1、饱和脂肪酸在小胶质细胞激活中的作用及机制研究【摘要】 神经系统退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimers Disease, AD)、帕金森病(Parkinsons disease,PD)、多发性硬化症 (Multiple Sclerosis, MS)和艾滋病痴呆复合征(the AIDS dementia complex)是常见的老年神经变性疾病,病因十分复杂。目前多数学者认为：神经胶质细胞活化引起脑内慢性炎症反应可能是神经系统退行性疾病发病的核心病理机制之一,小胶质细胞则是其最主要的炎症细胞。小胶质细胞是正常中枢神经系统(central nervous system, CNS)中重要的免疫
2、细胞。小胶质细胞主要呈分枝样或阿米巴样两种形状,不同的形态代表不同的功能状态：前者代表静息状态；后者代表激活状态。正常成熟 CNS中的小胶质细胞是静息的分枝状细胞,缺乏吞噬能力,但具有吞饮功能和一定的迁移能力,可清除代谢产物,起到“清道夫” 的作用。静启、状态的小胶质细胞通过分泌生长因子促进神经元的存活,并调节内源性免疫系统。另外,小胶质细胞可以清除神经元正常重塑过程中产生的细胞碎片,有利于神经元的发育存活。然而,当CNS 遭受损伤,如炎症、外伤,小胶质细胞可被激活,表现为胞体增大,细胞表面的突起紧缩,变短,增粗,从而由分枝状的静息小胶质细胞转变成无突起的激活的阿米巴样巨噬细胞,这些形态改变有
3、利于小胶质细胞的阿米巴样运动及发挥其吞噬功能。静息状态下小胶质细胞不表达或只是微弱地表达主要组织相容性抗原(major histocompatibility complex class, MHC) I,如酪氨酸磷酸酶 (CD)-45(即白细胞共同抗原) 、CD-14 、及 CD11b/CD18(Mac-1)。激活的小胶质细胞增加了细胞 MHC抗原的表达 ,研究表明 AD 及 PD 患者脑中 MHC 类抗原表达明显增加。在多种神经系统退行性疾病中,如 AD、PD 及 MS,小胶质细胞过度激活以及所释放的具有神经毒性的炎症介质可引起神经元和胶质细胞死亡。活化的小胶质细胞产生多种免疫效应分子,如白介
4、素(interleukin, IL)-1、IL-6、IL-8 、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-,TNF-)、转化生长因子-、前列腺素、趋化因子、分泌蛋白酶、氧自由基(reactive oxygen species, ROS)、一氧化碳(nitric oxide, NO)和兴奋性氨基酸等 ,从而引起局部或广泛 CNS 的损伤。这些免疫效应分子可通过不同的途径作用于胶质细胞或神经元促进其他炎症分子的产生；它们之间也相互影响、相互促进,引起神经元退行性变、局部的小胶质细胞激活及炎症参与的神经元退行性变的持续发展。近年来越来越多的研究表明饱和脂肪酸在 AD 发病中起重要作用
5、。其中流行病学调查发现富含饱和脂肪酸饮食是 AD 发病的危险因素之一。例如一项 21 年的追踪研究表明进食富含饱和脂肪酸的奶制品与中年后的认知和记忆损害有密切关系。其他研究也证明饱和脂肪酸饮食越多,中老年人的认知损害风险也越高。同时动物实验亦证实,饱和脂肪酸饮食能够促使啮齿类动物大脑发生与人 AD 类似的病理学变化以及学习和记忆功能的损伤。脂肪酸可自由通过血脑屏障,因此,大脑内脂肪酸的稳态维持依赖于外周脂肪酸浓度。富含饱和脂肪酸饮食能够促使更多的自由脂肪酸通过血脑屏障进入大脑。研究表明某些患有以饱和脂肪酸升高为特征的疾病(如心血管疾病、肥胖、型糖尿病及高血压等)的人群罹患 AD 的几率远高于其
6、他人群。另外,AD 患者脑内神经原纤维缠结含有较高的软脂酸(棕榈酸,plamitic acid, PA)和硬脂酸(stearic acid, SA),而其大脑白质中富含饱和脂肪酸。以上研究均提示饱和脂肪酸和 AD 两者之间关系密切。近年来研究表明在饱和脂肪酸 PA 和 SA 能促进大鼠脑神经元 tau 蛋白的磷酸化,上调 -分泌酶的活性。其机制可能是通过星形胶质细胞介导的,即促进星形胶质细胞过度合成神经酰胺所致。体外实验证实脂肪酸能够刺激 tau 蛋白和 -粉样蛋白的合成。但是 PA 不能使体外培养的下丘脑神经元发生炎症反应,也无法诱导胰岛素抵抗,这表明饱和脂肪酸诱发 AD 患者的中枢炎症可能
7、是通过非神经元细胞引起的。目前,关于饱和脂肪酸是否激活小胶质细胞,及对神经元功能的影响的尚不清楚。本课题以原代小胶质细胞和小胶质细胞系 BV-2 为主要体外模型,应用 western blot、免疫荧光、RT-PCR 和酶联吸附免疫测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法等研究饱和脂肪酸 PA 及 SA 刺激细胞释放炎症介质及其 mRNA 的时间和剂量效应关系,明确饱和脂肪酸是否具有激活小胶质细胞的作用,并检测 Toll-like receptor (TLR) 4/nuclear factorB (NF-B)在饱和脂肪酸活化小胶质细胞中的作用
8、,以并初步探讨饱和脂肪酸通过激活小胶质细胞诱发大脑神经元损伤的机制。一、饱和脂肪酸在小胶质细胞激活中的作用加入 10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的 dulbeccosmodifiedeagles medium (DMEM)培养基,在 37、5%CO2 培养箱中培养 BV-2 细胞。培养原代小胶质细胞：取出生 1-2 d 的 BALB/c 小鼠 ,无菌条件下取脑 ,剔除软脑膜及血管,快速切碎组织 ,胰蛋白酶 37消化 20 min,1000 rpm/min 离心 5 min,弃上清,加入 10%FBS DMEM/F12 培养基重悬细胞,接种至 60 mm 培养瓶中
9、,37 、5%CO2 培养箱中静置培养 14 d。其中每 3 d 换 1 次液。14 d 后,用 37恒温振荡器振荡(500 rpm/min) 2h,收集悬浮细胞,1000 rpm/min 离心 5 min,弃上清,种植密度 1106/ml。连续培养 10 d,经过 CD11b 免疫荧光鉴定,其纯度可达 97%,可以用于后续实验研究；等细胞密度达到 75%-80%后开始试验,使用前用不含FBS 的培养基孵育细胞,1 h 后加入含 PA、SA 或拮抗剂的无 FBS 的培养基孵育细胞进行实验。因为饱和脂肪酸不溶于水,所以我们首先溶解脂肪酸,将 PA 和 SA 溶解在无水乙醇中,制备为 200 mM
10、 的储存液。取实验所需适量浓度加至含有无脂肪酸低内毒素 BSA 的不含 FBS 的 DMEM 培养基,在其中脂肪酸：BSA的 molar:molar 为 10:1,50孵育 6 h,此时的脂肪酸与 BSA 结合,从而确保脂肪酸的浓度。为避免内毒素(lipopoly-saccharide, LPS)对饱和脂肪酸的污染作用,我们用显色基质鲎试剂法检测配置好 PA 及 SA 细菌内毒素的含量,结果显示 100M PA 和 100M SA 内毒素含量3.4510-3pg/ml(1.7710-5EU/ml),此剂量在本实验中不能激活小胶质细胞。数据用均数标准差表示,用 SPSS 统计分析软件进行统计学分
11、析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),P0.05),提示 25-100M PA 无细胞毒性。而 200M PA(66.824.91%)明显诱发细胞死亡(P0.05) 。另外 MTT 结果显示,在 BV-2 细胞中 25-100M SA 无细胞毒性；而在原代小胶质细胞中,25-100M PA 显示无细胞毒性。因此我们选取 25-100M PA 或 SA 作为后续实验剂量。同时 PA 是机体循环系统中含量最多的饱和脂肪酸,我们选取 PA 作为饱和脂肪酸激活小胶质细胞的机制研究的代表。小胶质细胞激活伴随细胞形态和细胞膜表面抗原的改变,因此我们首先检测 PA 孵育对小胶质细胞细胞形态和 C
12、D11b 表达的影响。在 100M PA 孵育 6 h 和 24 h 后,BV-2 细胞和原代小胶质细胞胞体增大 ,细胞表面的突起变短,从而由分枝状的静息小胶质细胞转变成无突起/或突起较短的激活的阿米巴样细胞。100M PA 或 LPS (500 ng/ml 阳性对照)孵育 24 h 后 ,细胞膜表面 CD11b 表达明显增加 ,进一步提示饱和脂肪酸可激活小胶质细胞。小胶质细胞激活后释放大量的炎症介质,后者导致神经元损伤和调亡。我们接下来观察 PA 对小胶质细胞释放炎症介质的影响。实验分为三组：对照组,PA 处理组和 LPS 处理组。RT-PCR 结果显示,用 25-100M PA 或 500
13、 ng/ml LPS孵育 BV-2 细胞 4h 后,PA 和 LPS 上调 TNF-、IL-1 及 IL-6 mRNA 的表达。另外,用 25-100M PA 孵育BV-2 细胞 12h、24h 及 48h 后,500 ng/ml LPS (?)呼育 24 h 作为阳性对照 ,收集细胞培养基,利用 ELISA检测炎症细胞因子水平。结果显示 PA 呈剂量依赖性和时间依赖性刺激小胶质细胞释放 TNF-、IL-1 及IL-6。而这种刺激效应在 PA 浓度为 100M,孵育 24 h 时呈现出最大刺激效应,故本研究选择 100M作为最佳刺激浓度,24 h 作为最佳刺激时间。100M PA 在 24 h
14、 诱发小胶质细胞释放 IL-1(409.4754.54pg/ml)明显高于阳性对照 LPS (306.9345.10 pg/ml),而 100M PA 在 24 h 诱发小胶质细胞释放TNF-(344.0618.38 pg/ml)和 IL-6(65.198.49 pg/ml)明显低于阳性对照 LPS 组(TNF-,451.1440.95 pg/ml; IL-6,209.8822.60 pg/ml)。被激活的小胶质细胞不仅有形态学上的改变,激活的小胶质细胞也活化了诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS), NO 产物增加,还原代谢产物降低,
15、导致神经元损伤和调亡。NO 的合成主要受 NOS 的调节,接下来我们检测 PA 对小胶质细胞释放NO 和 iNOS 表达的影响。实验分为三组：对照组,PA 处理组和 LPS 处理组。用 25-100M PA 孵育 BV-2细胞 12 h、24 h 及 48 h 后,LPS(500ng/ml) 孵育 24 h 作为阳性对照,收集细胞培养基,检测 NO 的水平。结果显示,PA 呈剂量依赖性和时间依赖性刺激 BV-2 细胞释放 NO。100M PA 在 24 h 诱发小胶质细胞释放NO(9.441.07M)明显高于对照组(2.580.42M), 而低于阳性对照 LPS 组(14.112.13M)。R
16、T-PCR 结果显示,25-100M PA 或 500 ng/ml LPS 孵育 BV-2 细胞 4h 后,iNOS mRNA 明显增加。免疫荧光标和western blot 结果显示 ,25-100M PA (?)孚育 BV-2 细胞 24 h,上调 iNOS 的表达。同时,与对照组(0.000.00)相比,PA 呈浓度依赖性上调 iNOS 水平,表达分别为 25M(0.2420.063)、50M(0.5980.049)、100M(0.6490.048);而 100M PA 处理组 iNOS 的表达高于阳性对照 LPS 组(0.5030.085)。另外,免疫荧光标检测结果表明,加入 PA(1
17、00M)或 LPS(500ng/ml)6h 后,BV-2 细胞和原代小胶质细胞膜上 iNOS 表达增加；而 PA 或 LPS 孵育 24h 后,iNOS 表达增加更明显。结果提示 PA 可能通过上调小胶质细胞中iNOS 的表达诱发 NO 的释放。目前认为 ROS 的过量表达是 AD、 PD 及 MS 等神经退行性疾病最终的共同发病机制,其主要来源于活化的小胶质细胞及功能受损的线粒体。接下来我们检测 PA 对小胶质细胞释放ROS 的影响。我们用 100M PA 孵育 BV-2 细胞 12 h 和 24 h 后,500ng/mL LPS 孵育 24 h 作为阳性对照,用 PBS 充分冲洗后,加入
18、10M H2DCFDA or 2M DHE 孵育 60 min 后,收集培养基,分别检测过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)和超氧 (superoxide, O2-)。结果显示,PA 或 LPS 孵育 24 h 后,显著诱导 BV-2细胞生成 ROS。与对照组(1.010.04)相比,100M PA(5.880.65)在 24 h 显著促进 H2O2 的释放,而低于阳性对照 LPS 组(7.250.19)。同时,与对照组(1.000.04) 相比,100M PA (4.590.28)在 24 h 显著促进O2-的释放,接近阳性对照 LPS 组(4.440.67)。为了检测
19、饱和脂肪酸对小胶质细胞的作用具有普遍性 ,我们用另一种饱和脂肪酸 SA 孵育细胞 4h,收集细胞 RNA,利用 RT-RCR 检测 TNF-、IL-1、IL-6 和 iNOS mRNA 的表达。结果显示,100M SA 孵育 BV-2 细胞 4 小时后,上调 TNF-、IL-1、IL-6 及 iNOS mRNA表达。以上结果提示饱和脂肪酸可诱导小胶质细胞的活化并释放大量的炎症反应因子。二、饱和脂肪酸激活小胶质细胞的作用机制在第一部分中我们发现,饱和脂肪酸激活小胶质细胞,引起炎症介质的释放,哪么PA 活化小胶质细胞的分子机制是什么?有关文献报道饱和脂肪酸激活巨噬细胞 NF-B, NF-B是 iN
20、OS、环氧化酶-2、TNF-、IL-1 和 IL-6 等基因表达的重要转录因子,因此我们接下来检测饱和脂肪酸是否可以激活小胶质细胞 NF-B。免疫荧光检测检测结果显示 ,100M PA 及 500ng/mL LPS 孵育 1h 后,细胞核NF-B p65 蛋白增强,而胞浆内的量逐渐减少,核易位现象明显。Westem blot 结果显示,与对照组(0.0100.04)相比,PA 呈浓度依赖性上调磷酸化 NF-B p65 水平,表达分别为 25M(0.2020.028)、50M(0.3420.066)、100M(0.4560.66)；而低于阳性对照 LPS 组(0.4780.042)。另外荧光素酶
21、报告基因检测显示,PA 孵育 24 h 后明显增加 NF-B启动子活性。与对照组(1.000.09)相比,PA 呈浓度依赖性增加 NF-B启动子活性,表达分别为 25gM(1.700.31)、50M(2.780.43) 、100M(4.060.64) ；而低于阳性对照 LPS 组(6.030.24)。接下来我们检测饱和脂肪酸激活小胶质细胞释放 TNFa、IL-1、IL-6 及 NO是否依赖 NF-B。实验分为三组：对照组 ,PA 处理组和 PA+吡咯烷二硫基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)处理组。RT-PCR 结果显示,与对照组相比,100M PA
22、处理组在 4h 明显上调TNF-、IL-1 、 IL-6 及 iNOS mRNA 表达,PA+PDTC 组 TNF-、IL-1、IL-6 及 iNOS mRNA 明显低于PA 处理组。同时 100M PA 在 24 h 显著诱发小胶质细胞释放 TNF-、IL-1、IL-6 及 NO,而 PA+PDTC组在 24 h 诱发小胶质细胞释放 TNF-、IL-1 和 NO 明显低于 100M PA 组。与 PA(65.198.49 pg/ml)单独作用相比,PA+PDTC 组(54.6010.09pg/ml) 并不影响 PA 诱导 IL-6 释放。有关文献报道饱和脂肪酸激活细胞膜上 TLR4,进而激活
23、 NF-B。我们利用 anti-TLR4 neutralizing 抗体(anti-TLR4 Ab)阻断 TLR4 后,观察 PA 对 NF-B活性的影响。实验分为三组：对照组 ,PA 处理组和 PA+anti-TLR4 Ab 处理组。结果显示anti- TLR4 Ab 显著抑制 PA 诱发的 NF-Bp65转位入细胞核。100MPA 在 24h 显著诱发小胶质细胞释放TNF-、IL-1 、 IL-6 及 NO。而 PA+anti-TLR4Ab 组在 24h 诱发小胶质细胞释放 TNF-、IL-1、IL-6(和NO 明显低于 100MPA组。以上结果提示饱和脂肪酸激活小胶质细胞 TLR4/NF
24、-B,引起下游的 TNF-、IL-1、IL-6 及 NO 的释放。三、饱和脂肪酸激活的小胶质细胞诱导神经元死亡从第一、二部分显示饱和脂肪酸可激活小胶质细胞,那么这种作用是否能引起神经元的损伤呢?为了验证此假说,我们首先培养原代神经元：取出生 1-2 天的 BALB/c 小鼠,无菌条件下取脑,剔除软脑膜及血管,快速切碎组织,胰蛋白酶 37消化 20 min,1000r/min 离心 5 min,弃上清,种植密度 1106。于无血清 Neurobasal+B27 培养基,37 、5%CO2 培养箱培养 7d。7d 后,去除无血清 Neurobasal+B27 培养基,加入来源于饱和脂肪酸处理 BV
25、-2 的培养基。BV-2 细胞种植于 60 mm 的培养瓶中,达到 7580%的密度时,用含有 25-100M PA 无血清DMEM/F12 培养基孵育 12h,去除培养基,再加入新鲜无血清 DMEM/F12 培养基孵育 12h,收集小胶质细胞上清液作为神经元条件培养基(microglia conditioned medium, PA-CM)同时收集无 PA 的小胶质细胞上清液作为对照小胶质细胞条件培养基(control CM, control-CM),然后将收集的条件培养基过滤 ,储存在-20 冰箱备用。将收集的条件培养基加入神经元的培养中,观察细胞的活性及凋亡情况。实验分为两组：contr
26、ol-CM 处理组和 PA-CM 处理组。实验结果显示 ,与 control-CM 相比,PA-CM 孵育 48 h 可明显诱发神经元凋亡。为探讨小胶质细胞条件培养基促进神经元凋亡的机制,我们检测了 Bcl-2、Bax 和 Caspase3 的表达,RT-PCR 结果显示,用 25-100M PA-CM 孵育神经元 24 h 后,上调 Bax mRNA 的表达,下调 Bcl-2 mRNA的表达,PA-CM 处理组 Bax/Bcl-2 显著高于 control-CM 组。Western blot 结果显示,PA-CM 处理组Cleaved caspase 3 的表达水平明显高于 control-
27、CM 组,提示 Caspase-3、Bax 和 Bcl-2 共同参与了饱和脂肪酸对神经元的促凋亡作用。本研究显示饱和脂肪酸可激活小胶质细胞,使其有静息状态转变成激活的阿米巴样细胞；同时引起下游的 TNF-、IL-1、IL-6、NO 及 ROS 的释放；另外,我们发现饱和脂肪酸可激活小胶质细胞的 NF-B,用 PDTC 特异性阻断 NF-B后,TNF-、IL-1 及 NO 分泌减少；利用 TLR4 特异性抗体拮抗 TLR4 后,减弱饱和脂肪酸诱导的 NF-B的激活,同时抑制 PA 诱导 TNF-、IL-1、IL-6 及NO 的分泌；PA 激活的小胶质细胞能明显促进神经元死亡,并上调 Bax 和 Caspase-3 表达。综上所述,饱和脂肪酸可激活小胶质细胞 TLR4/NF-B信号途径,引起下游的 TNF-、1L-1、IL-6 及 NO 等的释放；这些炎症介质通过调节 Caspase-3、 Bax 及 Bcl-2 的表达,共同参与了饱和脂肪酸对神经元的促凋亡作用,最终诱导神经元死亡。本实验提示饱和脂肪酸可诱导小胶质细胞激活,为进一步揭示高饱和脂肪酸饮食诱发CNS 慢性炎症的发病机制以及临床治疗提供理论依据。
