1、河北大学 2009 级本科生学年论文（课程设计）1一 前言人类基因组计划完成后，美国于 2001 年 9 月正式启动了“功能糖组学”研究项目，项目的总体目标就是阐明由蛋白质- 糖链相互作用的介忖的细胞通讯机制。基因组计划提供了最基本的遗传信息。而许多基因的功能仍需要阐明。其中的关键就是要了解蛋白质翻译后的修饰，而蛋白质的糖基化便是最主要的翻译后修饰之一。河北大学 2009 级本科生学年论文（课程设计）2二 本论蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种加工过程，是蛋白质一种重要的翻译后修饰 【1】 。2.1 蛋白质糖基化定义蛋白质的糖基化是指在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成
2、糖苷键的过程。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质功能作用。具体过程：N-连接的糖链合成起始于内质网，完成与高尔基体。在内质网形成的糖蛋白具有相似的糖链，由 Cis 面进入高尔基体后，在各膜囊之间的转运过程中，发生了一系列有序的加工和修饰，原来糖链中的大部分甘露糖被切除，但又被多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子，形成了结构各异的寡糖链。糖蛋白的空间结构决定了它可以和那一种糖基转移酶结合，发生特定的糖基化修饰。许多糖蛋白同时具有 N-连接的糖链和 O-连接的糖链。O-连接的糖基化在高尔基体中进行，通常的一个连接上去的糖单元是 N-乙酰半乳糖，连接的部位为 Ser、Thr 和 Hyp
3、 的OH 基团 【2】 ，然后逐次将糖基转移到上去形成寡糖链，糖的供体同样为核苷糖，如 UDP-半乳糖。糖基化的结果使不同的蛋白质打上不同的标记，改变多肽的构象和增加蛋白质的稳定性。在高尔基体上还可以将一至多个氨基聚糖链通过木糖安装在核心蛋白的丝氨酸残基上，形成蛋白聚糖。这类蛋白有些被分泌到细胞外形成细胞外基质或粘液层，有些锚定在膜上。22 蛋白质糖基化分类2.2.1N-连接的糖基化糖通过与蛋白质的天冬酰胺侧链的酰胺氮连接而修饰蛋白质，所以将这种糖基化称为N-连接的糖基化， N 位糖基化根据其末端精细结构的不同又可分为高甘露糖型、复合型和杂合型。这一过程是在内质网中进行的。糖基化的第一步是将一
4、个 14 糖的核心寡聚糖添加到新形成多肽链的天冬酰胺上，其氨基酸的特征序列是 Asn-Xaa-Ser/Thr(Xaa 是除Pm 外的任何氨基酸)，这种序列被认为是 N 位糖基化的先决条件 【3】 。 核心寡聚糖是由 N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖和葡萄糖组成。这种寡聚糖同 ER 膜中的磷酸多萜醇(dolichol phosphate)紧紧相连。被转移到新生肽上的寡聚糖在 ER 中会进一步加工，主要是切除三分子葡萄糖和一分子甘露糖。多萜醇是长链的醇,具有很长的疏水尾部能够紧紧的结合在膜的双脂层上。核心寡聚糖链是结合在多萜醇的磷酸基上,当 ER膜上有蛋白质合成时,整个糖链一起转移。2.2.2 O-连接的
5、糖基化河北大学 2009 级本科生学年论文（课程设计）3O-连接的糖基化是将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基上的氧连接来修饰蛋白质。此糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上。但并没有发现特异的序列作为糖基化位点 【3】 。O-连接的糖基化是由不同的糖基转移酶催化的, 每次加上一个单糖。2.3 糖蛋白的检测方法2.3.1 荧光染色检测法该方法建立在蛋白质组学技术基础上，利用高通量的双向凝胶电泳技术先分离总蛋白。然后再结合一些特殊荧光染料对糖蛋白进行染色。如 Pro-Q Emerald 488 染料能够与高碘酸氧化后的糖蛋白共价结合，产生高荧光共轭化合物，此共轭化合物在 4
6、73nm 或者 488nm波长激发下能产生绿色荧光信号，这样就能很好的将糖蛋白在 2DE 凝胶上显示出来了。2DE 凝胶还可以用 SYPRO Ruby 染料等进行后染色，所有蛋白质被染成红色，而糖蛋白与Pro-Q Emerald 的共轭化合物呈绿色。此方法能检测到 58 ng 的糖蛋白，这主要取决于蛋白糖基化程度的不同和糖成分的不同。该灵敏度比标准的 PAS 法高出 816 倍 【4】 。2.3.2 与凝集素联用的染色检测方法：蛋白质经过聚丙烯酰胺凝胶分离，印迹到聚偏二氟乙烯膜上，然后与标记了地高辛的凝集素一起孵育，再通过与带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合，最后加入显色试剂进行检测。此方法检测
7、糖蛋白的灵敏度约为 15ng，依赖于蛋白质的性质和糖基化程度。PRO Q 有三类凝集素试剂盒：伴刀豆凝集素 A 用于检测末端有 a-甘露糖吡喃糖苷残基或 a葡萄糖吡喃糖苷残基且不具有三天线或四天线结构的糖蛋白 【5】 ；小麦胚芽凝集素（WGA）用于检测有 N 乙酰神经氨酸的糖；西非单叶豆凝集素用于检测末端有非还原性的 N 乙葡糖胺的糖蛋白。还可以用结合了辣根过氧化物酶的伴刀豆凝集素素 A 或小麦胚芽凝集素等标记糖蛋白，再用显色剂显色。2.3.3 其它检测方法可用酶解或化学裂解的方法将糖链从糖蛋白中释放出来，经过 2-氨基苯甲酸等标记，用毛细管电泳或高效液相色谱等分离，再由检测器检测，以及用质谱
8、，核磁共掁等方法来进行检测。2.4 蛋白质糖基化的意义与免疫2.4.1 蛋白质糖基化的生物学意义在进化上：寡糖链具有一定的刚性，从而限制了其他大分子接近细胞表面的膜蛋白，这就可能使真核细胞的祖先具有一个保护性的外被，同时又不像细胞壁那样限制细胞的形状与运动。2.4.2 蛋白质糖基化异常与自身免疫病河北大学 2009 级本科生学年论文（课程设计）4机体对抗原刺激的免疫应答最终均由免疫分子所介导。免疫分子包括免疫球蛋白、细胞因子、补体、分化抗原、组织相容复合体分子等。免疫球蛋白的寡糖链不仅在维持空间构象，稳定糖蛋白的结构以及保护其免受某些蛋白酶裂解等有重要作用；而且寡糖亦能改变某些蛋白质的抗原特性
9、，从而使机体对产生自身免疫应答，导致自身免疫性疾病。河北大学 2009 级本科生学年论文（课程设计）5三 结论与展望蛋白质的翻译后修饰,包括糖基化，将证明是对于发生在生物学体系中“新陈代谢”的极好控制，当基因产品在蛋白质活性组织中被修饰时，这一点尤为明显，多糖结构中，可利用的广泛的差异性使其成为微调新陈代谢的最佳部分。而糖基化研究的基本目标就是寻找编码糖蛋白的基因（即基因组信息）寻找糖基化位点（即糖基化位点信息）析糖链及糖基化肽段的结构（即结构信息） ；研究糖基化的功能（即功能信息） 。随着分离技术，检测技术的迅速发展，蛋白质糖基化研究的方法和策略也将呈现出多样性糖基化，蛋白组研究也将成为翻译
10、后修饰研究中的一个新热点。河北大学 2009 级本科生学年论文（课程设计）6参考文献1Kobata A. Structures and functions of the sugar chains of glycoproteins. Eur J Biochem,1992,209:4835012赵洪亮,刘志敏.蛋白质糖基化工程.中国生物工程杂志,2003(9):18-203李军,杜鑫,Hosseini Moghaddam S.H.,陈玉银,蛋白质糖基化修饰研究进展,科技通报,2009（11）：773-7784Hart C，Schulenberg B，Steinberg TH，eta1Detection of glycoproteins in polyacrylamide gels and on electroblots usingPro-Q Emerald 488 dye，a fluorescent periodate Schiff-base stain JEleetruphoresis，2003，24(4)： 588-5985张倩,杨振,张艳贞,王爱丽,安学丽,晏月明.蛋白质糖基化的研究方法及其应用.生物技术通报;2006 年第 1 期:46-49
