1、改良的盐酸羟胺法测生物样品 SOD 活性一 SOD（T-SOD ）活力测定：原理：羟胺在有氧环境下发生自氧化可产生超氧阴离子，产生的超氧阴离子可由 NBT 还原率而检测，在 SOD 存在下，超氧阴离子被分解，NBT 还原被抑制。因此，用比色法测定 NBT还原产物可以间接反映 SOD 的酶活力。仪器：可见光分光光度计试剂：75mM Na 2CO3 /NaHCO3 缓冲液（pH=10.2，含 0.15mM EDTA-Na2）5mM NH2OHHCl0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml甲酸步骤：1. 用 1:5 组织匀浆（血清可直接取样） ，3000
2、rpm 离心 30min，取上清 20ul 稀释至 0.1ml2. 按顺序加入如下试剂：75mM Na2CO3 /NaHCO3 缓冲液 2.0ml5mM NH2OHHCl 0.5ml0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml3. 立即计时，于 37恒温水浴 10min（避光） 。4. 2.0ml 甲酸终止反应。5. E560nM 比色，记录 OD 值。计算结果：酶单位表示：在本实验条件下，抑制率达 50%所对应的提取液 SOD 含量即一个 SOD 单位（U） 。可用每 g 蛋白（U/g protein）表示。 %10SOD值对 照 组 值实 验 组值
3、对 照 组抑 制 率 OD二 Mn-SOD 活性测定：基于氰化物抑制 CuZn-SOD 非 Mn-SOD 活性的原理，在上述缓冲液中加入 KCN，使最终反应体系中的 KCN 浓度达到 2mM，即将缓冲液配成含 3mM 的 KCN。37孵育 45 分钟，以抑制 CuZn-SOD。其余操作、步骤、计算方法同上。三 CuZn-SOD 酶活力 = T-SOD 酶活力单位 Mn-SOD 酶活力注意事项：1) 对照组（非酶管）取样品同体积的三蒸水，其余步骤同样品。2) 若测血中 SOD，可取血清 20ul，其余地操作步骤同上。来自：第四军医大学硕士王建宏学位论文诊断剂量超声对鼠胚胎和人绒毛脂质过氧化及超微
4、结构的影响 。导师：钱蕴秋。单位及专业：西京医院超声诊断科，超声诊断学。1991.5-1992.6。参考秦绪军、常耀明硕士论文原始参考文献：1、 Kono Y. Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Arch Biochem Biophys. 1978 Feb; 186(1):189-95. 或者 Yasuhisa Kono. Generation of superoxide radical during autox
5、idation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Anchives of Biochemistry and Biophysics. 1978 Feb; 186(1):189-95.2、 Yisun et al. Free Rad Res Comms 1988; 4:299-309.刘树元制作2003-5-7荧光法测定血清脂质过氧化产物（MDA）原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（简称 MDA） ，可与硫代巴比妥酸（简称 TBA）缩合，形成红色产物。此红色物质在波长 532nm 有极大吸收峰，可用分光光度法进行定量测定
6、。若以 515nm 为激发光，则在 553nm 有最强荧光强度，故可用荧光法进行微量测定。灵敏度高，再现性好，试样用量少，是该方法的优点。仪器：荧光分光光度计试剂：1) MDA 标准储备液（1mmol/L 四乙氧基丙烷或四甲氧基丙烷水溶液）：准确称取22.03mg1，1，3，3-四乙氧基丙烷加水定容至 100ml，放 4冰箱，可保存三个月。2) MDA 标准应用液（1mol/L）：准确量取标准储备液 0.1ml 于 100ml 容量瓶中，用水稀释至刻度，用时再准确稀释（现用现配） 。3) 1/24mol/L H2SO4 4) 10% 磷钨酸溶液5) 0.67 硫代巴比妥酸（TBA）：新鲜配制（
7、溶于水与冰醋酸等体积混合液） 。6) 正丁醇（水饱和）步骤：血清样品 50l1/24mol/L H2SO4 4.0ml10%磷钨酸 500l混匀放置 5min 2000rpm 离心 10 分钟弃上清 ，空在滤纸上1/24mol/L H2SO4 2.0ml10%磷钨酸 300l混匀放置 5min， 2000rpm 离心 5 分钟弃上清 ，空在滤纸上样品管 空白管 标准管双蒸水 1.0ml(震 1 分钟) 1.0ml /标准品 / / 1/0.5/0.25/0.125/0.0625 各 1.0ml0.67TBA 1.0ml 1.0ml 1.0ml振荡、混匀 100准确水浴 1h取出流水冷却至室温正
8、丁醇（水饱和） 4.0ml振荡抽提 1 分钟，2000rpm 离心 5 分钟取上清（正丁醇层）约 3.0ml(若出现混浊，可加一滴无水乙醇)测定荧光强度，激发光（ 515nm）发射光（553nm）计算结果：丙二醛浓度=0.51.00/0.051.05/0.5f/F = 21f/F nmol/ml 血液f：样品溶液的荧光强度F：标准溶液的荧光强度注意事项：弃上清时，不要回手。改良荧光法测定还原型谷胱甘肽原理：OPT 在 PH 为 8.0 的时候与还原型谷胱甘肽合成 GSH-OPT，在一定的激发波长和发射波长下进行荧光测定，从而对 GSH 进行定量。仪器：荧光分光光度计试剂：1）0.1%邻苯二甲醛
9、（ OPT）溶液：临用前称取 OPT10mg 溶于 10ml 甲醇，混匀。2）0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液（含 5mmol/L EDTA）：称取 Na2HPO4.12H2O 35.814g、 EDTA-Na2 1.861g，用蒸馏水溶解并定容至 1L，调节 pH 至 8.3。3）1：4 甲醛溶液：1 体积甲醛加 4 体积磷酸盐缓冲液混合。4）GSH 标准储存液：新鲜配制，将 GSH 配成 1mg/ml 水溶液5）GSH 标准应用液：新鲜配制，取标准储备液用水稀释成 0.5ug/ml 的溶液。6）10%的三氯醋酸溶液步骤：试剂（ml） 测定管 标准管 空白待测样品 0.2 应用液 0.2 双
10、蒸水 0.210%的三氯醋酸 0.2 0.2 0.2摇匀，室温静置 10 min，5000g 离心 10min,，吸上清上清液 0.1 0.1 0.1甲醛 0.1 0.1 0.1摇匀，静置 5min0.1mol/L 缓冲液 3.6 3.6 3.6摇匀，立即加入 OPT 溶液 0.2ml，摇匀，静置 40min测定：激发波长 350nm, 发射波长 425nm，空白调 0，读取荧光读数。计算结果：GSH 浓度 (umol/L)= 1000307.3注意事项：1）GSH 的浓度是在 2.5ug/ml 内，线性关系良好，最低检出限为 25ng/ml。2）本法测定过程中，加入 OPT 后，40min
11、荧光值达最高读数，在其后 20min 内稳定。3）可用偏磷酸沉淀剂代替 10%的三氯醋酸，但须在 40C 下完全沉淀。4）用三氯醋酸沉淀蛋白，为达到最佳 PH 值 8.0，故使用 pH8.3 的磷酸盐缓冲液。5）甲醛的作用是降低非特异性干扰。测定管荧光读数标准管荧光读数荧光法测定氧化型谷胱甘肽原理：OPT 在 PH 为 12 时，与 GSSG 特异地结合成 GSSG-OPT，在一定的激发波长和发射波长下可进行荧光测定，从而对 GSSG 定量。N-乙基马来酰亚胺（NEM ）能与 GSH 络合，并防止 GSH 转变为 GSSG，可用来消除 GSH 转变为 GSSG 对 GSSG 含量测定结果的影响
12、。仪器：荧光分光光度计试剂：1）25%偏磷酸2）1mg/mlOPT ：用甲醇配制。3）0.04mol/L NEM 水溶液4）0.1mol/L NaOH5）GSSG 标准液：0.5ug/ml，用 0.1mol/LNaOH 配制。步骤：1）样品制备：采集全血，加入 0.06 体积的 SBE 抗凝， 12000g 离心 1.5min，分离上清，冰浴待测。或取组织 0.5g，加入 7.5ml 磷酸钠-EDTA 缓冲液、25%偏磷酸溶液 2ml，制成 5%的匀浆。室温下 6500g 离心 15 分钟，分离上清液，置冰浴中待测。2）吸取 0.5ml 上清，加入 0.2ml NEM 溶液，室温静置 30mi
13、n。3）加入 0.1mol/L NaOH 溶液 4.3ml，混匀待测。4）加样检测：试剂（ml） 0 1 2 3 4 5 样品管GSSG 标准液 0 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 /待测样品液 / / / / / / 0.1NaOH 2.0 1.9 1.5 1.0 0.5 0 1.9OPT-甲醇液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1GSSG 含量（g） 0 0.05 0.25 0.5 0.75 1.0将各管混匀，室温下静置 30min选择激发波长 337.8nm，发射波长 421.6nm，以标准曲线中的 0 管作对照，测定各管荧光强度。计算结果：以 GSSG 标准
14、液的浓度为坐标横轴，以其对应的荧光强度值为坐标纵轴，绘制标准曲线，求直线回归方程。将样品管的荧光测定值代入方程，可直接求出待测样品中的 GSSG 的含量。注意事项：1）OPT 可与 GSH 在 PH8.0 时结合，故可测定 GSH 含量，用 0.1M 磷酸钠 0.005M EDTA缓冲液(pH8.0) 替换 NaOH，同时样品不用 NEM 处理。2）GSSG 及 GSH 在室温下形成荧光物质需一定时间，20min 尚不能稳定，25min 反应基本完全，2h 内稳定不变，故选择 30min。3）本法的特点是可同时测定 GSH 与 GSSG。分光光度法测定谷胱甘肽过氧化物酶的活力原理：谷胱甘肽过氧
15、化物酶（GPX）可促进氢过氧化物与还原型谷胱甘肽的反应。谷胱甘肽过氧化物酶的活力，可以其酶促反应的速度来表示。另外，利用氧化型谷胱甘肽和辅酶 2在谷胱甘肽还原酶作用下的反应，测定辅酶 2 的减少，亦可求出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。测定酶促反应中过氧化物或还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力，ROOH+2GSH ROH+GSSG+H2OH2O2+2GSH 2H2O+GSSGGSSG+2NADPH NADP+GSH仪器：可见光分光光度计试剂：1）叠氮化纳磷酸缓冲液（PH7.0）：NaN 3 0.065g、EDTA-Na 2 11.6g、Na 2HPO4.12H2O 8.74g、 NaH2PO4.
16、2H2O 2.43g，以双蒸水溶解，稀释至 100ml，再以 NaOH 调节 pH 至7.0，4保存。2）1.0mmol/L GSH 溶液：须当日配制。称取 GSH 3.07mg，以叠氮化纳磷酸缓冲液溶解并稀释至 10.0ml。3）1.25-1.50mmol/L 的 H2O2 溶液：须当日配制。吸取 30% H2O2 13ul，以蒸馏水稀释至100ml。4）偏磷酸沉淀液：含 1.67%偏磷酸、0.05% EDTA 及 28%NaCl。称取适量试剂后用三蒸水溶解，可微微加热促溶，充分溶解后趁热过滤。5）0.32mol/L 的磷酸氢二钠溶液6）DTNB 显色液：称取 0.04g DTNB、柠檬酸纳
17、 1.0g 溶于蒸馏水中并稀释至 100ml，盛于棕色瓶 4可保存一个月。步骤： 1）GSH 标准曲线的制定 (ml)：10ml 的容量瓶中试剂（ml） 1 2 3 4 5 6GSH 液 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00偏磷酸沉淀液 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0GSH 系列 （mol/L）0 20 40 60 80 100标准液系列 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0磷酸氢二钠 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5DNTB 溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.55mi
18、n 内 422nm 比色，以蒸馏水调 02）全血 GPX 的测定 (ml)：GSHPXGSHPX GSHPX 样品制作：采集全血 50ul，蒸馏水稀释到 2.0ml酶促反应（样品管） 非酶促反应（非酶管） 空白管GSH 液 0.4ml GSH 液 0.4ml /血样稀释液 0.4ml 蒸馏水 0.4ml /37水浴 5min 37水浴 5min /H2O2（37预温）0.2ml H2O2（37预温）0.2ml /偏磷酸沉淀液 4.0ml 偏磷酸沉淀液 4.0ml 显色反应(调 0)混匀后，3000rpm 离心 10min上清 2.0ml 上清 2.0ml 蒸馏水 0.4ml偏磷酸 1.6ml磷
19、酸二氢钠 2.5ml 磷酸二氢钠 2.5ml 磷酸二氢钠 2.5mlDTNB 0.5ml DTNB 0.5ml DTNB 0.5ml422nm5min 内读取光密度计算结果：GPX= Log(非 OD空 OD)log(样 OD空 OD)3min0.004ml谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定DTNB 直接显示法一原理 测定酶促反应中 GSH 的消耗量，则可求出酶的活力。 （注意最后计算时，必须扣除非酶促反应所引起的 GSH 减少部分。 ）GSH-Px2GSH+H2O2 GSSG+2H2OGSH 量的测定：GSH+DTNB 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子 该产物呈较稳定的黄色，测定其在 422nm 波
20、长的光吸收值，可计算出 GSH 的量，从而可反映并计算出 GSH-Px 的活性。二试剂与仪器1.试剂1）叠氮化纳磷酸缓冲液（PH7.0）2）1.0mmol/LGSH 溶液(当日配制 )3）1.25-1.50mmol/L 的 H2O2 溶液（当日配制)4）偏磷酸沉淀液5）0.32mol/L 的磷酸氢二钠溶液6）DTNB 显色液2.仪器 可见光分光光度计 离心机三操作步骤 GSH 标准曲线的制作1 2 3 4 5 61mmol/L GSH （ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 偏磷酸沉淀液 （ml） 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0蒸馏水 （ml） 2.0 1.8
21、 1.6 1.4 1.2 1.0各取出 2.0ml 置入新管0.32mol/L Na2HPO4 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5DTNB. 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5五分钟之内于 422nm 比色，蒸馏水调零 全血 GSH-Px 的测定取鼠血 20l，蒸馏水稀释至 2.0ml。试剂（ml） 样品管 非酶管 空白管1mmol/L GSH 0.4 0.4 / 蒸馏水 / 0.4 /血样稀释液 0.4 / /H2O2（37预温） 0.2 0.2 /37准确反应 3min偏磷酸沉淀液 4.0 4.0 /3000rpm 离心 10min蒸馏水 / / 0.4偏磷酸沉淀液 / / 1.6取上清 2.0 2.0 /0.32mol/L Na2HPO4 2.5 2.5 2.5DTNB 0.5 0.5 0.55min 之内于 422nm 比色
