1、叉鞭金藻多糖的分离纯化及体外抗氧化作用研究周 妍，王 凌，孙利芹，王长海(烟台大学海洋学院，山东烟台264005)摘要：叉鞭金藻多糖(DAP)经琼脂糖凝胶柱层析进行分级，得到了DAP一1和DAP一22个组分，分别对这2个组分进行了纯度和分子质量的测定，并考察了对羟自由基OH、超氧阴离子O 的清除效果，以及对H：O：诱发小鼠红细胞氧化溶血的抑制作用和对小鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用结果显示，两个组份的组成相对均一，能显著或极显著清除OH、O ，抑制小鼠红细胞溶血，并能显著抑制小鼠肝脂质过氧化的产生，且呈现剂量依赖性其中DAP一2的抗氧化活性较DAPl好，其对OH、0 的清除率最高可达852 和7
2、60 ，对小鼠红细胞的溶血抑制率和脂质过氧化的抑制率分别可达836 和893 关键词：叉鞭金藻；多糖；分离纯化；抗氧化中图分类号：Q9492 文献标识码：A随着陆地资源的逐渐枯竭，人们逐渐将研究方向转向海洋，从海洋生物中寻求新的天然抗氧化剂、新的抗衰老药物等已成为医药、食品等领域的重要目标叉鞭金藻(Dicrateria sp)是一种经济价值较高的海洋单细胞微藻，广泛用于虾、贻贝、牡蛎等多种海珍品的人工养殖 目前对叉鞭金藻的研究主要集中在：(1)高密度培养的研究，以生物量形式作为饵料的应用；(2)用作污水处理中的cu、Pb 等有害金属离子的生物吸附剂；(3)有机磷农药对其生长繁殖抑制机制的研究，
3、从而进一步研究海洋微藻的致毒性 J此外对于叉鞭金藻活性物质的研究中对其合成不饱和脂肪酸的研究较多，而对于其多糖研究的报道很少，多数仅停留在多糖含量的测定上本文从叉鞭金藻多糖的提取纯化人手，获得不同组分的多糖并对其体外抗氧化作用进行研究，以期为叉鞭金藻多糖作为食品添加剂或海洋药物的开发提供一定的参考1 材料与方法11 材料与仪器叉鞭金藻(Dicrateria sp)原种购于中国海洋大学种质库，实验用藻种由烟台大学海洋生化研究所纯化并保存药品：邻苯三酚，国药集团化学试剂有限公司；邻二氮菲，天津市大茂化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Sanlandehem International Inc
4、；H O ，天津市大茂化学试剂厂；七水和硫酸亚铁，烟台三和化学试剂有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)，上海试剂二厂以上试剂均为分析纯清洁级昆明种小鼠，雄性，体重2022 g，山东绿叶制药有限公司(许可证号：SYXK(鲁)20030020)主要仪器：UV1601紫外可见分光光度计，日本SHIMAZU公司产品；BSZ一100自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂；HL一2S恒流泵，上海沪收稿日期：2009-0713资助项目：山东省自然科学基金资助项目(Y2007D59)；烟台大学大学生科技创新基金资助项目(080605)作者简介：周妍(1985一)，女，山东东营人，硕士研究生，研究方向：海洋活性物质；通
5、讯联系人：王长海(chwang2001sinatom)，教授，博士生导师290 烟台大学学报(自然科学与工程版) 第23卷西分析仪器厂；Agilent 1 100型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司12 方法121 叉鞭金藻粗多糖的制备新鲜培养的叉鞭金藻藻液经离心后，加入5倍体积的去离子水，置于一4冷冻，然后取出融化，如此反复3次获得水溶性提取物；将冻融后的溶液超声破碎，离心10 rain，取上清液在水浴中加热，浓缩至原体积的13，加人体积分数为3 的三氯乙酸沉淀蛋白，12000 rmin离心10 rain，取上清液；加入5倍体积的95 乙醇，离心取沉淀洗涤、透析、冷冻干燥得白色粉末为粗多
6、糖DAP L3 J122 粗多糖的分级与纯化将叉鞭金藻粗多糖DAP配成5 mgmL的水溶液，上平衡好的Sepharose 6B琼脂糖凝胶层析柱(35 cm80era)用0O1 molL的NaC1溶液梯度洗脱，流速06 mLmin，按管收集，用硫 葸酮法于620 nm处检测糖的吸光度，得到多糖的洗脱曲线根据洗脱曲线分段收集，合并相同组分，浓缩，加人5倍体积的95 乙醇使其完全沉淀，离心收集沉淀，加蒸馏水，透析脱盐，冷冻干燥即得多糖精品123 多糖纯度和分子量检测将DAP制成02 的溶液，经022 m滤膜过滤后，取滤液20注入液相色谱仪，色谱柱为TSKGel一4000Pw凝胶色谱柱(10 m，75
7、 mm300 mm)，流动相为双蒸水，流速为05 mLmin，示差检测器温度为35，分析时间为40 rain记录色谱图，并根据标准单糖测定的普适标准曲线计算DAP分子质量124 抗氧化活性的检测(1)羟自由基(OH )清除实验取075moLL邻二氮菲溶液1 mL于试管中，加入400mmoLL PBS(pH 74)缓冲液2 mL和蒸馏水1mL，充分混匀后，加25 mmoLL硫酸亚铁溶液1mL，混匀，加20 mmoLL H2O2 1 mL，于37水浴15 h，在536 nm处测其吸光度，记做A ；用1 mL蒸馏水代替1 mL H：0 ，测得的吸光度记做A ；用DAP 1 mL代替1 mL蒸馏水，测
8、得的吸光度记做A _4 J 按下式计算OH自由基清除率：A (2)超氧阴离子(O )清除实验各管分别加入005 moLL TrisHC1(pH 82)缓冲液46mL，加入1 mL多糖溶液，混匀后在25水浴保温10 rain，取出后立即加入在25 预热过的006 moLL邻苯三酚溶液03 mL(对照管加入10 mmol1 HC1 03 mE)各管充分混匀，准确反应3 rain(加入邻苯三酚时开始计时)后加入5 Vc01 mL终止反应10 min后，在420 llm处测定吸光度，记做A ；对照管以1 mL蒸馏水代替待测样品，记做A：l5 J按下式计算0 清除率：A A(3)多糖对H 0：诱发小鼠红
9、细胞氧化溶血的影响昆明小鼠眼球取血，肝素抗凝，2000 rmin离心6 min，弃血浆，所剩红细胞用4倍量生理盐水洗涤及同法离心，洗3次后用生理盐水悬浮，调红细胞体积分数为05取红细胞悬浮液1 mL，加人100 mmolL H20：(空白管不加H202)及多糖溶液1 mL，37 oC温育1 h，加入4倍量生理盐水稀释，3000 rmin离心6 min，上清液于415nm处测吸光度 溶血按下式计算抑制率，用线性回归求算Ic(4)多糖对小鼠肝匀浆脂质过氧化作用的测定小鼠眼球取血后，迅速分离肝组织，将肝组织用冰冷的TrisHC1缓冲液(20 mmolL)经研磨棒制备成20的肝匀浆使反应体系中含肝匀浆
10、液02 mL，FeSO 的终浓度为)l0 ImolL，Vc的终浓度为01 mmolL，及不同浓度的多糖，在37温浴1 h，保温结束后加入20三氯乙酸(TCA)10mL终止反应，混匀，再加入067硫代巴比妥酸(TBA)15 mL，沸水浴加热15 rain离心去除蛋白质沉淀后，于532 nm测定吸光度(以TrisHC1缓冲液为空白) ，按下式计算抑制率：125 数据处理实验结果以均值4-标准差表示采用t检验对实验结果进行分析，P005)，其余浓度组DAP一2对小鼠脂质过氧化的抑制作用均显著或极显著高于DAP一14 讨论羟自由基和超氧阴离子等活性氧自由基会对机体产生一系列的毒害作用，如损伤蛋白质的巯
11、基和氨基，使蛋白质变性、交联，使酶的活性丧失；损伤DNA，导致细胞突变；进攻多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，导致生物膜结构和功能的改变等 J炎症、衰老、肿瘤等疾病的起因和发展都与自由基和脂质过氧化作用有关 J因此，寻找能够抑制自由基和脂质过氧化的物质尤其是天然物质越来越受到生物学家和医学家们的重视许多多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化的作用L1 许多海藻多糖因具有硫酸基等电负性基团而表现出较高的抗氧化能力卜”，但由于多糖结构的不均一性，如分子量过大、难溶解、极性、组成的不均一等，使分离纯化和鉴定存在一定的困难，这在一定程度上限制了多糖生物活性的研究目前用于研究的多糖多以粗多糖
12、为主，少有均一多糖活性方面的研究报道本实验通过琼脂糖凝胶柱层析对叉鞭金藻多糖(DAP)进行分级纯化，得到了组成相对均一的DAP一1和DAP一2两个组分，高效液相色谱分析结果表明其均为组分相对均一的多糖随后测定了2个组分多糖的体外抗氧化作用，实验发现，叉鞭金藻多糖2个组分均能显著或极显著地清除OH、O ，抑制H O 诱导的小鼠红细胞溶血，并能显著抑制小鼠肝脂质过氧化的发生分子质量较小的DAP一2的抗氧化活性较DAP一1更强，这与我们对不同分子质量的紫球藻多糖的抗氧化结果一致 ，说明分子质量对多糖的生物活第4期 周 妍，等：叉鞭金藻多糖的分离纯化及体外抗氧化作用研究 293性有一定影响，其具体机制
13、还有待深入研究参考文献：1 钟婧，吕小梅，李光，等几种环境因子对叉鞭金藻种群增长的影响J中国野生植物资源，2006，25(6)：44-462 唐学玺，李永棋，董宝贤有机磷农药对海洋微藻致毒性的生物学研究J海洋通报，1996，15(1)：27303 郭忠武，王来曦糖化学研究进展J化学进展，1995(1)：10294 Smimof N，Cumbes Q JHydroxyl radical scavengingactivity of compatible solutesJPhytochemistry，1989，28(4)：71-735 夏晓凯，张庭廷，陈传平黄精多糖的体外抗氧化作用研究J湖南中医杂志
14、，2006，22(4)：906 葛斌，陈立德，张振明4一磺酸酯一2，2，6，6一四甲基哌啶氮氧自由基对大鼠组织和红细胞的抗脂质过氧化作用J中国药理学与毒理学杂志，2001，15(1)：47507 张全斌，于鹏展，周革非，等海带褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性的研究J中草药，2003，34(9)：11138 李俊丽，王运强，向长萍南瓜水溶性多糖的体外抗氧化作用J华中农业大学学报 2007，26(2)：256 2599 Cuzzocrea S，Riley D，Caputi A P，et a1Antioxidanttherapy：a new pharmacological approach in shoc
15、k，inflammation，andischemiareperfusion injuryJPharmacol Reviews，2001，53：135-15910 辛晓林，刘长海中药多糖抗氧化作用研究进展J北京中医药大学学报，2000，23(5)：54-5511 张尔贤，俞丽君鼠尾藻多糖清除氧自由基作用的研究II UVc鼠尾藻对多糖抗氧化作用的影响J中国海洋药物，1997，17(3)：l-412 朱海波，王长海，郑秋生海带多糖对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用J烟台大学学报：自然科学与工程版，2008，21(3)：20420813 周慧萍，蒋巡天，王淑如，等浒苔多糖的降血脂及其对SOD活力和LPO
16、含量的影响J生物化学杂志，1995，11(2)：161-16414 Sun Liqin，Wang Changhai，Shi Quanjian，et a1Preparation of diferent molecular weight polysaccharides fromPorphyridium cruentum and their antioxidant activitiesJInternational Journal of Biological Macromolecules， 2009(45)：42-47Separation and Purification of Polysacchar
17、ides from Dicrateria spand Their Antioxidant Activities in vitroZHOU Yan，WANG Ling，SUN Liqin，WANG Changhai(School of Ocean，Yantai University，Yantm 264005，China)Abstract：Two kinds of polysaccharides called DAP-1 and DAP-2 ale seperated from Dicrateria sp by sephrose-6Bthe purity and molecular weight
18、of them are determinedThe scavenging efeats on hydroxyl freeradical(OH )and superoxide anion(0 )of DAP一1 and DAP-2 are investigated in vitroThe inhibitingefects of the two poly saccharides on RBC hemolysis induced by H2 O2 and on lipid peroxidation of liver homogenate are also examminedTh e results
19、show that DAP一1 and DAP-2 obtained by sephrose-6B are homogeneous polysaccharidesthey both show dosedependent scavenging activity on OH and O and remarkbleinhibiting efect on RBC hemolysis and lipid peroxidation of liver homogenate In addition，DAP-2 showsstronger antioxidant activity than DAP一1，its
20、elimination ratio on hydroxyl free radical and superoxide anionradical can reach 852 and 760 respectivelyThe inhibition ratio of DAP-2 on RBC hemolysis inducedby H2 O2 and on lipid peroxide of liver homogenate can reach 836 and 893 ，respectivelyKey words：Dicrateria sp；polysaccharide；separation and purification；antioxidant activity(责任编辑 周雪莹)
