1、SDS-PAGE 电泳标准操作规程1、目的建立 SDS-PAGE 电泳的标准操作规程,确保电泳操作有序进行，保证电泳的安全性、有效性。2.范围与职责适用 SDS-PAGE 电泳操作岗位。配制岗位操作人员对本标淮实施负责，QA 检查员、生产主管负责监督。3.程序：3.1. 制胶3.1.1 组装胶架 将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。3.1.2 分离胶的配置 3.1.2.1 10%分离胶配方如下表：10%胶 蒸馏水 30%Acr-Bis(29:1)1.5M Tris-Hcl PH 8.810%SDS 10%AP(过
2、硫酸铵)TEMED5 ml 1.3 ml 1.7 ml 1.9 ml 0.05 ml 0.05 ml 0.007ml3.1.2.2 灌胶 混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约 1cm)。 3.12.3 液封 在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约 30min 观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。3.1.3 浓缩胶的配置 3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：5%胶蒸馏水30%Acr-Bis(29:1) 0.5M Tris-Hcl PH 6.81
3、0%SDS 10%AP(过硫酸铵)TEMED2 ml1.4 ml0.33 ml 0.25ml 0.02 ml0.02 ml0.02 ml3.1.3.2 插入制胶梳 混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约 30 分钟，聚合完全。3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽 将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块 10%的凝胶板分别插到 U 形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入 1X tris-gly 电泳缓冲液。3.2.2 样品处理
4、 对于蛋白样品直接取 80l 的样品，依次加上 20l 5x buffer (加了 B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加 100ul 2x buffer (加了 B-巯基乙醇)煮沸10 分钟。3.2.3 加样 用移液枪取处理过的样品溶液 10l，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker 可加在不同的孔槽中。3.2.4 电泳 将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v 保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。3.2.5 剥离胶 把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短
5、玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。3.3. 染色放于加有 R250 染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为 45r/min，时间约 1 小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。3.4.脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为 45r/min，时间约 1 小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。3.5.拍照 将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹） ，放到扫描仪上，拍照。4. 注意事项4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为 100KD-50KD 选用 10%胶；50KD-3
6、0KD 选用 12%胶；30KD-10KD 选用 15%胶。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约 1cm 左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用 2-3 次。4.8 AP 和 TEMED 是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。5. 异常情况处理：操作过程中设备发生不正常或故障时，应及时告知负责人，及时处理。
