1、1酶联荧光 RFLP 技术标准1 全血或冻溶血抽提 DNA1.1 全血溶解注：1）细胞溶解液（cell Lysis Buffer）和蛋白酶 K（pro-k）在使用时，置放在冰盆内。2）蛋白溶解液（Protein Lysis Buffer）应放在室温。3）操作中全部试剂的用量是依据 0.5ml血液样本而设定的，应精确保用各试剂用量。移取 0.5ml全血，加入标记 5ml管。加 1.8ml细胞溶解液到各试验管，加盖，倒转数次使其混匀，置于冰盆内待到全部试验样本操作完备后，准备离心。在水平台式离心机上离心，1250rpm，离心时间 5min，注意在离心前一定要配平。从离心机取出样本，仔细地倒去上清液
2、，用新华滤纸吸取残剩上清液。注意，不要将离心沉淀物（pellet）丢掉。假若沉淀物被悬浮，就将样本管垂直放置，小心吸弃上清液。在旋涡混合器上，用残存上清液悬浮沉淀团。每样本管加 2ml细胞溶解液，加盖，在旋涡混合器上，混匀沉淀团，重复第 3-4步骤。再在旋涡混合器上，混匀样本。在第 6步骤离心时，按下列配方准备蛋白酶混合液。每个样本 10 20 30 40 50 60Protein lysis Buffer233.8l 2.338ml 4.676ml 7.014ml 9.352ml 11.69ml 14.028mlPro-k 3.7l 37l 74l 11l 140l 185l 222lSDS
3、 12.5l 125l 250l 375l 500l 625l 750lTotal 250l 2500ml 5ml 7.5ml 10ml 12.5ml 15ml2每样本管加蛋白酶混合液 250l，加盖，轻轻地倒转数次，禁止剧烈振荡。将全部样本管放入恒温水浴摇床内，371培养 2hrs，中速摇动。每管加 50l 高氯酸钠（Sodium Porchlorate）加盖，轻轻地倒转数次，进入抽取步骤。1.2 DNA抽取注：1）抽提溶液 I，II，III 都是剧毒试验，应带乳胶手套、口罩，在通风处操作。2）用前，全部抽提溶液复温。3）对于上述全部样本管按下列步骤进行操作。每样本管加等体积抽提溶液（约 0
4、.5ml） ，加盖扣紧，在室温倒转使之混合。将全部样本管配平后，放置在水平离心机内 2000rpm，离心 7min。Phenol 相（淡黄色的有色相）在样本管液体的上层，吸弃 Phenol相，继续进入第 5步骤，假若 Phenol相在样本管底部，液相（无色相）在上层，吸移上层液相和带有白色的界面层到新的管内，丢去 Phenol相。每样本加等体积抽提溶液 II（约 65ml）加盖扣紧，在室温倒转使之混匀。离心 2000rpm，离心时间 7min，吸移上层相和界面到新管内。每管加等体积抽提溶液，加盖扣紧，倒转混合。离心 2000rpm，时间 7min，离心后小心从离心机内取出样本管，吸取上清部分，
5、准备透析。2 透析 DNA2.1 准备透析用具，试验器械、透析管、透析夹、透析液、容器、磁力搅拌机。2.2 配制透析液 1：100 透析贮存液，配制 2000ml。2.3 准备透析管：将透析管剪成 5cm长，一端用已标记透析夹封住，浸泡在透析液过夜备用。2.4 将透析管从透析液中取出，用滤纸吸去残留透析液，吸移样本管上层相，放入透析管内，避免吸取界面，用透析夹封住另一端，放回透析液中，注意，3认真验对透析夹与样本编号相对应，并记录。2.5 样本透析在 4冰箱中进行，磁力搅拌机搅动透析样本，每 4h换一次透析液，共 3次。2.6 已经透析的大分子 DNA在室温是稳定的，在 4可以短期保存抽提 D
6、NA，若需要长期保存，应贮存在乙醇中，若者是在 0.3M Ammonium Acetate。禁止冷冻大分子 DNA。3 DNA定量3.1 制备 0.8% Agarose凝胶Agrose 1.2g1TAE Buffer 150ml加到 300ml三角烧瓶摇匀，放置微波炉中 2min，移出，用力水平摇匀，再放置微波炉 20 秒，待冷至 65后，加 10lEB(mg/ml)，将 150l 溶解胶，倾入水平的制胶板框内，在一端插入 17孔的梳子，在室温使凝胶固化 45分钟备用，将已制好凝胶板浸入电泳槽缓冲液中，注入 1TAE缓冲液 2000ml，缓冲液面有胶面上 1cm为宜。3.2 在 65的干热器上
7、，将 DNA定量标准 30NG、20ng、10ng、5ng、1ng 和 DNA可视性大小标准，放置在干热器上 5min，离心。3.3 吸取样管 DNA 2l（吸前注意将样本混匀）与 8lloading Buffer在微量反应板上混匀，备用。3.4 加样，依次从右向左加 DNA定量标准和样本：3.5 电泳条件：输出端电压 90V（或经过混胶两端电压调至 50V） ，万用表检测其直流电压，电泳时间 1hr，关闭电源。在电泳时，需要观察电压，电流，以确保电泳在进行，简便的方法是观察两侧电极是否有电解气泡连续上浮，示运转正常，也可观察溴酚兰向阳极进行性迁移。3.6 电泳结束后，将凝胶板从电泳槽取出，放
8、置紫外分析仪上，观察结果，并用一次成像记录结果，F5.6，曝光 1/2秒，显像 60秒。3.7 比对记录样本 DNA含量。台 Yield Gel 5.1a,5.1b,5.1c,5.1d所示。1. DNA大小标准 10l DNA含量2. 30ng/l DNA 10l 300ng/well/(band)3. 20ng/l DNA 10l 200ng/well/(band)4. 10ng/l DNA 10l 100ng/well/(band)45. 50ng/l DNA 10l 50ng/well/(band)6. 2.5ng/l DNA 10l 25ng/well/(band)7. 1ng/l D
9、NA 10l 10ng/well/(band)以上8. 2l DNA 样本 8l 22B 10l 10ng/well/(band)以上9. 2l DNA 样本 8l 2LB 10l 10ng/well/(band)以上10. 2l DNA 样本 8l 2LB 10l 10ng/well/(band)以上11. 2l DNA 样本 8l 2LB 10l 10ng/well/(band)以上12. 2l DNA 样本 8l 2LB 10l 10ng/well/(band)以上13. 2l DNA 样本 8l 2LB 10l 10ng/well/(band)以上14. 2l DNA 样本 8l 2L
10、B 10l 10ng/well/(band)以上15. 2l DNA 样本 8l 2LB 10l 10ng/well/(band)以上16. 2l DNA 样本 8l 2LB 10l 10ng/well/(band)以上17. 2l DNA 样本 8l 2LB 10l 10ng/well/(band)以上4 Hae限制酶消化样本 DNA注意：1）Hae限制酶在使用前从冰箱取出，放置冰上，用后立即冷冻保存-20。2）阳性对照和样本从第一步开始。3）在使用前，立即准备，限制酶反应液，放置冰上备用。4.1 根据 DNA定量结果，决定每个样本需要的 l 数。每个样本取 4g DNA，就足以满足遗传信息
11、、亲权鉴定、个体识别的 RFLP三次分析。因此，每个样本以 4g DNA 计算，来推算所要样本的 l 数，体积加 dH2调到 200l。样本 DNA浓度 所需样本的 l 数 dH2O150ng/l 27l 173100ng/l 40l 16095ng/l 67l 14750ng/l 80l 12025ng/l 160l 40阳性对照的 DNA浓度为 100 ng/l，即取阳性对照 40l，dH 2O。4.2 按每份样本所需限制性酶反应液 200l，配制内切酶混合，充分混匀备用，按下列比例配制。名 称 每份样本所需量DH2O 116lHae Buffer 40lMgCl2 40lHae 酶 4l
12、终体积 200l4.3 每管加 200l 限制性酶反应液，在旋涡混合器上简捷地混匀，在微型离心机上 200xg,2min使内容沉降管底部。54.4 在 371 培育 2hrs，在离心机上 2000xg,2min。操作到此步骤时，可暂 时停止实验，样本-20贮存。4.5 每管加 200l 平衡盐，在旋涡混合器振荡 5sec，静置在冰上 10min或者放置冰箱冰格内 10min。4.6 在微型离心机上 10000rpm离心 10min，以沉淀蛋白质。移取上清液到新标记的 1.5ml管内，因为，沉淀物用肉眼难以分辨，在操作时，避免吸收管底沉淀的蛋白质和其它沉淀物。4.7 在室温，给每管加 95% E
13、thanol 1.0ml，倒转充分混合，室温静置2030min。4.8 在微型离心机上 13000rpm离心 20min，弃去上清液，用滑低吸附残留上清液。4.9 每管 70% Ethanol 1.0ml，倒转，充分混合。4.10 沉淀 DNA在微型高速离心机上离心 13000rpm 100,20min。仔细吸弃上清液。注意：沉淀团（DNA）与管壁附着的不牢固，避免粗心将沉淀团弃去。滤纸吸去残留上清液。4.11 干燥沉淀 DNA，放置在抽风的超静台内，空气干燥 23hrs。有条件时，可在真空干燥器内，干燥 510min。到此步骤可以暂停止实验，样本 DNA放置-20。4.12 每管加 40l
14、无核酶酸 dH2O,在 65培育 5min，旋涡振荡器上，充分混合。再放置 65培育 5mins。4.13 放在旋涡振荡器完全悬浮 DNA，把样本管微型离心机上简捷离心，使内容物沉于管底部，操作到此步骤时，样本 DNA可放置-20贮存。5 检测酶切 DNA片段与再消化 DNA5.1 检测酶切 DNA片段5.1.1 制备 0.8% Test Gel，取：Agarose 1.2gGel Buffer 150ml在三角烧瓶混匀，放置微炉中 2min，取出用力顺时针摇动，使沉地瓶底的Agarose悬浮，再微波炉里，20Sec，充分溶化，观察瓶的液体的琼脂糖，凝胶6为无色、透明、均匀液体，待温度降至 5
15、5时，加入 10l 溴化乙锭，混合，将液体琼脂糖注入制胶模框内，插入梳子，室内固化 30mins备用，注意：带手套、避免手接触 EB。5.1.2 取 0.8%凝胶板，放置电泳槽内，注入 1Ggel Buffer，使液体面在胶上1cm为宜。5.1.3 制备样本，每管取 5l 酶切 DNA样本，加入 l 2Loading Buffer混合于 1.5ml管内。5.1.4 培育全部待测样本，可视性大小标记和 Hae TestGel 质控对照，放置65 5min。5.1.5 在旋涡荡器上混合，简捷离心，沉降内容物。5.1.6 加样，依次加入可视性大小标记，Hae TestGel质控对照和样本DNA。5.
16、1.7 电泳，端电压 90V，经过 Gel，电压 50V，电泳时间 1hr，随时注意观察电泳现象。5.1.8 电泳结束后，把胶板放置紫外分析仪上，观察桔黄荧光的电泳谱带，用一次成像照像记录结果。如图 Test Gel 5.2A,5.2B,5.2c所示。5.1.9 结果分析，比较待测样本 DNA的电泳谱带与 Hae TestGel质控对照电泳谱带的迁移率和荧光强弱。Hae TestGel荧光亮度相当于 500ng的 DNA，在 5l 的样本中，也应含有大约 500ng DNA，才能适合 Analytical Gel的用量。5.1.10 假若样本 DNA荧光强度不如 Hae TestGel质控对照
17、，应再取 4g DNA样本重新消化。假若样本 DNA荧光强度超过 Hae TestGel（500mg） ，应对样本用 dH2O进行稀释。样本编号 用 量 内 容第 1孔 10l Visual Marker第 2孔 10l Hae TestGel 质控对照第 3孔 10l 样本 DNA第 4孔 10l 样本 DNA第 5孔 10l 样本 DNA第 6孔 10l 样本 DNA第 7孔 10l 样本 DNA第 8孔 10l 样本 DNA第 9孔 10l 样本 DNA7第 10孔 10l 样本 DNA第 11孔 10l 样本 DNA第 12孔 10l 样本 DNA第 13孔 10l 样本 DNA第 1
18、4孔 10l 样本 DNA第 15孔 10l 样本 DNA第 16孔 10l 样本 DNA第 17孔 10l 样本 DNA5.1.11 分析后，酶切 DNA样本量（500ng） ，消化程度与 Hae TestGel 相同，即可进行 Analyticd Gel电泳。5.2 再消化样本 DNA5.2.1 在 Test Gel电泳分析后，认为样本 DNA消化不良，应进行再次消化。5.2.2 每管加 5lHae Buffer和 4lHae 酶，在旋涡荡器上混匀，简捷离心。5.2.3 在 37恒温浴摇床上，摇动、培育 2hrs。5.2.4 在 65热处理 5min，简捷离心，使内容物沉于管底。5.2.5
19、 假若，在 Test Gel电泳分析后，仍有样本消化不良，将样本弃去，重新取全血样本提取 DNA。5.3 分析凝胶电泳5.3.1 样本准备：将样本 DNA从冰箱移取解冻，加入 40l 2Loading Buffer混匀。5.3.2 将全部待测样本，等位基因对照，分子量大小标准和联合对照简捷离心，使内容物出现于管底。5.3.3 在 65干加热培育 10min，简要离心，备用。5.3.4 10% Analytical Gel制备Agarose 1.5gGel Brffer 150ml在微波炉加热溶化后，制成 Analytical Gel。具体操作参照 Test Gel制备法。5.3.5 加样：人类
20、基因分型时，按下列次序以次加样，右起第一孔 Idenfity Combination Standard第 17孔加 Identity Sizing Standard,各10l，216 孔加样本 DNA 20l。8假若亲子鉴定，按下列次序加样样本孔 样本内容1 Identity Combination Standard （10l）2 例 1：母 （20l）3 例 1：子 （20l）4 例 1：指控父亲 （20l）5 例 1：子与控指父亲样本混合 （各 10l）6 Identity Combinatros Standard （10l）7 Identity combinatros Stardard
21、（10l）8 Allelic Control （10l）5.3.6 电泳条件：凝胶两端电压 19V，电泳 20hrs。在电泳结束前 1hrs，在电泳槽里加入 200lEB，其中阳极加入 100lEB，阴极加 100lEB。5.3.7 结束电泳，在 UV灯下照相记录 Analytical Gel电泳结果，假若可视性标准的第四条（1.01kb）电泳谱带，距加样孔 12cm，表示电泳已经完成。假若达不到，继续电泳。如 analytical Gel 5.3a,5.3b所示。5.4 Southern转印 DNA到尼龙膜5.4.1 配制转印溶液5.4.2 将 Analytical Gel浸入 500ml变
22、性溶液里，室温在摇床缓慢摆动30min。注意不要超过 30min。5.4.3 准备尼龙膜用 HB2#铅笔在尼龙膜右上角标记，案例编号，日期和使用探针。5.4.4 取 2L变性溶液注入变性槽内，用 3M滤纸浸变性溶液后搭桥。5.4.5 仔细将变性处理的 Analytical Gel面向下，铺在桥纸上，排掉气泡。变性溶性 贮存液 用量 500ml 3L 6LNaCl(0.5m) 5M 50 300 600NaOH(0.5m) 10N 25 150 300DH2O 425 2550 51005.4.6 将标记好的尼龙膜贴有 Analytical Gel上面，标记面向上，排掉气泡。5.4.7 用 Pa
23、rafilm把 Analytical Gel四边封好，确保 Analytical Gel仅接触上转印的滤纸。5.4.8 放置 2张用 2SSC浸泡的 blotting paper，在尼龙膜上，排掉气泡。5.4.9 放置 3张干的 blotting paper在湿的 blotting paper之上。5.4.10 放置 5cm厚的新华滤纸在干 blothing paper之上。5.4.11 在最上面加有机玻璃平板和 500g重物。95.4.12 在室温转移应大于 6hrs或者过夜。5.5 固定限制性 DNA片段5.5.1 转印结束后，取出尼龙膜。5.5.2 准备 500ml 2SSC，戴上手套，
24、用手洗去尼龙膜残留胶块。5.5.3 将尼龙膜在室温自然凉干 10min。5.5.4 将尼龙膜放置 80杂交箱内 30min，烤干。5.5.5 将尼龙膜放置在 UV-CrosseLinker-2400自动交联仪上，12000100uj/cm2，进行自动交联两次。5.5.6 进入杂交步骤，或者装在塑料袋内贮存，备用。5.5 单位点探针与转印膜杂交5.5.1 配制下列试剂： 1Quich-Light Buffer 100ml Quick-Light dH2O Buffer 900mlA液 B液 DH2OWash 洗液 40 150 710Wash 洗液 4 50 946Wash 和 Wash 在室温
25、可贮存一周。5.5.2 将 Lumi-Phose 480放置室温，使用前将 Wash ，Wash 和杂交液（不含探针）在 55水浴 90min。5.5.3 每张尼龙膜取 Wash 30ml，装在盘内，在室温振荡 510min。5.5.4 在操作第 3步时，每张尼龙膜 10ml杂交液和 10l Nice Probe混合，使用前在 55培育 10mins。5.5.5 倒弃 Wash ，将预热的 Nice probe和杂交液装在塑料袋内杂交 55 2025min。注意：在 55培育不要超过 30min，结是的背景将会加深。5.5.6 倒掉杂交液，将尼龙膜放置洗盘内，每张膜加 Wash 100ml，在
26、 55水浴振荡至少 5min。5.5.7 倒掉 Wash ，加每张膜 Wash 100ml，在 55水浴振荡至少 5min，倒掉 Wash 。5.5.8 1QLB 200ml，室温轻轻漂洗 3次，使尼龙膜浸入剩余的 1QLB 中。5.6 荧光素自显影。5.6.1 将尼龙膜铺在塑料袋夹上，用喷雾器向膜面均匀喷 LumiPhose 480，将塑料夹两面贴上，排除气泡和多余的 LumiPhose 480。105.6.2 用热合机将塑料袋四边热封，确保 Lumi-phose 480不会漏出。5.6.3 将封好的尼龙膜袋放置在 X光片夹里，以下进入暗房操作。将 X光片贴于尼龙膜表面，合上暗盒，在 37曝
27、光 2hrs，或者室温过夜。假若背景和主要带太暗，应缩短曝光时间。5.6.4 数字化仪分析结果将全部样本的 RFLP图谱的汉族群体遗传学信息，经过数字化扫描分析仪，输入计算机。把已获得的图谱信息，转变成等位基因片段长度的 bp数据，列出等位基因，基因频率，杂合性测量，Hard-Weinbery 平衡吻合度检验，建立本地区群体的基础数据库。5.7 剥脱杂交探针与再杂交5.7.1 预热 Wash 651。5.7.2 每张膜加入 100ml Wash 。5.7.3 在恒温水浴摇床上，轻轻摇动 30min，浴温 651。5.7.4 倒掉 Wash ，进入杂交的操作步骤。5.7.5 尼龙膜剥脱后，也可空气干燥室温贮存。
