1、沉降菌测试标准操作规程第 1 页 共 5 页文件题目 沉降菌测试标准操作规程制 定 人制定日期 生效日期部门审阅审阅日期 文件编号SOP-JA-041-04QA 审阅审阅日期 替 代SOP-JA-041-03批 准 人批准日期 颁发部门 质量管理部分发部门 中化室 变更原因及目的按照 2010 年新版 GMP，对部分内容进行修订1、目的、范围、责任：1.1 目的：建立沉降菌测试的标准操作规程。1.2 范围：本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中沉降菌的测试条件，测试方法。本标准适用于医药工业洁净室和洁净区，无菌室或无菌区域(包括洁净工作台)的沉降菌的测试和环境验证。1.3 责任人：检验员、化验室
2、负责人。2、引用标准：GB/T162942010 ， 新版 GMP3、定义：本标准采用下列定义：3.1 沉降菌：用本标准提及的方法收集空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数3.2 沉降菌菌落数：规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以个/皿表示。4、测试方法：4.1 方法概述：本测试方法采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室(区)的洁净度。4.2 人员的职责及培训：洁净室(区) 的测试人员应进
3、行本专业的培训并获得相应资格后才能履行对洁净室（区）测试的职责，其中包含涉及的卫生知识和基本微生物知识。洁净室(区) 的测试人员应选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式，外面的衣服不能带进 100000 级以上的区域。4.3 仪器：4.3.1 培养皿：一般采用90mm15mm 规格的培养皿。4.3.2 培养基：大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（ SDA）或用户认可并经验证了的培养基。其配制方法见附录 B。沉降菌测试标准操作规程第 2 页 共 5 页4.3.3 恒温培养箱：必须定期对恒温培养箱进行校验。4.3.4 高压蒸汽灭菌器：使用时应严格按照仪器说明书操作。4.4 测试
4、步骤：4.4.1 测试前培养皿表面必须严格消毒。4.4.2 将已制备好的培养皿按采样点布置图逐个放置，然后从里到外逐个打开培养皿盖，使培养基表面暴露在空气中。4.43.3 静态测试时，培养皿暴露时间为 30min 以上，动态测试时，培养皿暴露时间为不大于 4h。4.4.4 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。4.4.5 采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在3035培养箱中培养，时间不少于 2 天，采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在 2025培养箱中培养，时间不少于 5 天4.4.6 每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定 3只
5、培养皿作对照培养。4.5 菌落计数： 4.5.1 用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用 510 倍放大镜检查，有否遗漏。4.5.2 若平板上有 2 个或 2 个以上的菌落重叠，可分辨时仍以 2 个或 2 个以上菌落计数。4.6 注意事项：4.6.1 测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。4.64.2 采取一切措施防止人为对样本的污染。4.6.3 对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。4.6.4 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微
6、镜鉴别。4.6.5 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。5、测试规则：5.1 测试条件：在测试之前，要对洁净室（区）相关参数进行预先测试，这类测试将会提供测试沉降菌的环境条件，例如：a)温度和相对湿度：洁净室（区）的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应（温度控制在 1826，相对湿度控制在 45%65%之间为宜） ，同时应满足测试仪器的使用范围。b)室内送风量或风速的测试或压差的测试；c)高效过滤器的泄漏测试。5.2 测试状态：静态和动态两种状态均可进行测试。静态测试时，室内测试人员不得多于 2 人。沉降菌测试前，被测洁净室（区）由使用者决定是否需要预先消毒。
7、测试报告中应标明测试时所采用的状态和室内的测试人员数。沉降菌测试标准操作规程第 3 页 共 5 页5.3 测试时间：5.3.1 在空态或静态 a 测试时，对单向流洁净室（区） ，测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于 10min 后开始；对非单向流洁净室（区） ，测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于 30min 后开始。在静态 b 测试时，对单向流洁净室（区） ，测试宜在生产操作人员撤离现场并经过 10min 自净后开始；对非单向流洁净室（区） ，测试宜在生产操作人员撤离现场并经过 20min 自净后开始。5.3.2 在动态测试时， ，则须记录生产开始的时间以及测试时间。5.4 沉降
8、菌菌落数计数： 5.4.1 采样点数量及其布置：5.4.1.1 最少采样点数目： 面 积最 少 采 样 点 数 注：对于 100 级的单向流洁净室（区） ，包括 100 级洁净工作台，面积指的是送风口表面积；:对于 10000 级以上非单向流洁净室（区） ，面积指的是房间面积。5.4.1.2 采样点的位置：可参照悬浮粒子测试。a)工作区采样点位置离地 0.8m1.5m 左右（略高于工作面） ；b)可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。5.4.2 最少培养皿数：在满足最少测点数的同时，,还宜满足最少培养皿数，见表 2.表 2 最少培养皿数：洁净度级别 所需 90mm 培养皿数(以沉降 0.5
9、 h /静态或 4h /动态计)A 14C 2D 25.4.3 采样次数：每个采样点一般采样一次。5.4.4 采样注意事项：5.4.1.1 对于单向流洁净室（区）或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流洁净室（区） ，采样口向上。5.4.4.2 布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。5.4.4.3 采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少活动。5.4.4.4 应采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样本的污染。5.4.4.5 培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行对照试验，每次或每个区域取一个对照皿，与采样同法操作但不需要暴露采样
10、，然后与采样后的培养皿（TSA 或 SDA）一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。5.5 结果计算：5.5.1 用计数方法得出各个培养皿的菌落数。5.5.2 每个测点的沉降菌平均菌落数的计算，见式= M1+M2+Mn Mn 沉降菌测试标准操作规程第 4 页 共 5 页式中： 平均菌落数；MM11 号培养皿的菌落数 M22 号培养皿的菌落数Mnn 号培养皿的菌落数n 培养皿的总数。5.6 结果评定：5.6.1 每个测点的沉降菌的平均菌落数必须低于所规定评定标准的界限。5.6.2 在静态测试时，若某测点的沉降菌平均菌落数超过评定标准，则应重新采样两次，两次测试结果均合格才能判为符合。附录 B 培
11、养基的灭菌及准备B.1 大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）：酪蛋白胰酶消化物 15g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g氯化钠 5g 琼脂 15g纯化水 1000ml取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节 PH 值使灭菌后为 7.30.2，加入琼脂，加热融化后，分装，灭菌，冷却至约 60，在无菌操作要求下倾注约20ml 至无菌平皿（90mm）中。加盖后在室温放置凝固。B.2 采用沙氏培养基（SDA）：葡萄糖 40g 酪蛋白胰酶消化物、动物组织的胃酶消化物等混合 10g 琼脂 15g 纯化水 1000ml 取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节 PH 值使灭菌后为 5.60.2，加入琼脂，加热融化后，分装
12、，灭菌，冷却至约 60，在无菌操作要求下倾注约20ml 至无菌平皿（90mm）中。加盖后在室温放置凝固。B.3 培养基平皿培养及保存：制备好的培养基平皿宜在 28保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜方法在平皿上做好培养基的名称、制备日期记录的标记。附录 C 洁净室（区）沉降菌的控制标准静态洁净度级别 A B C D沉降菌最大允许数 个/皿 1 3 10培养皿暴露时间 30min，以平均菌落数表示动态：洁净度级别 A B C D沉降菌最大允许数 1 45 90沉降菌测试标准操作规程第 5 页 共 5 页个/皿监测周期 1 次/月 1 次/月 1 次/月培养皿暴露时间不超过 4h，以平均菌落数表示
