1、新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研制谭玉华，冯健明，卢顺舵，罗建安，李建国，季涛，李贵情（广州市丰华生物工程有限公司，广州 510730 ）摘要：目的 利用时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）技术，建立新生儿促甲状腺素（Neonatal TSH）微量检测法，并研制其检测试剂盒。方法 采用了一株 TSH 单克隆抗体用于固相包被，另一株 TSH 单克隆抗体用于标记铕（Eu 3+） ，固相双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法检测 Neonatal TSH。结果 自建的Neonatal hTSH TrFIA 法灵敏度高可达 2.28U/ml，且在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数
2、 r 达 0.9987。与 hLH、hFSH、HCG 无明显交叉反应。分析内或分析间质控结果在靶值25%内，室内低质控、高质控分析内和分析间变异系数( CV)分别为 7.12%和 6.09%，7.82%和 7.03%。与 DELFIA Neonatal TSH 试剂标准品进行准确性比对实测值与标示效价比平均值为 1.05。与 DELFIA Neonatal TSH 试剂比对试验符合率一致，相关性系数 r 可达 0.9822。试剂盒室间质评能力比对成绩100%。结论 自建的 Neonatal TSH TrFIA 法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，精密性好和非放射性等优点，具有良好的临床应用价值
3、。关键词：新生儿；促甲状腺素；时间分辨荧光免疫分析Time-resolved Fluoroimmunoassay of Neonatal Hypothyropin and Preparation of Its Test ReagentTan Yu-hua,Feng Jian-ming, Lu Shun-duo, Luo Jian-an, Li Jian-guo, Ji Tao,Li Gui-qing( Guang zhou Fenghua Bio-engineering Co.,LTD,Guangzhou 510730 China)Abstract: Objective To establis
4、h a method of Time-resolved Fluoroimmunoassay(TrFIA) for the quantitative determination of human thyroid stimulating hormone(hTSH) in blood specimens dired on filter paper as an aid in screening newborns for neonatal hypothyroidism,and to prepare its test reagent .Methods The method based on solidph
5、ase sandwich TrFIA for Neonatal Hypothyropin(Neo-hTSH),which used two anti-TSH monoclonal antibody -one was coated on microplates and another was labeled by Europium. Results The assay sensitivity of the method was 2.28U/ml.The correlation coefficient of self made kits curve was 0.9987.There was no
6、obvious cross-reaction to human luteinizing hormone(hLH) , human follicle stimulating(hFSH) and human chorionic gonadotropin(HCG).The intra-assay and the inter-assay measured values of controls were not more than 25% difference from their labeled values, still their intra-assay and the inter-assay c
7、oefficients of variation(CV) of low and high controls were 7.12% and 6.09%, 7.82% and 7.03%,respectively. The correlation coefficient of self made Kit and DELFIA Neonatal TSH kit was 0.9822,and the results of self made Kit and DELFIA Neonatal TSH kit were showing no difference. The labs proficiency
8、testing was excellent. Conclusions The Neonatal TSH TrFIA established which has several advantages including high sensitivity, strong specificity, good accuracy, nice precision, and non-radioactive immunoassay. It is suitable for clinical use.Key words: Neonatal; Hypothyropin; Time-resolved Fluoroim
9、munoassay新生儿血液中促甲状腺素（Neonatal TSH）浓度升高(出生 72 小时后采血)是原发性甲状腺功能低下症（CH）最早的实验指标。CH 是造成儿童智力低下和生长发育迟缓的重要疾病之一。通过新生儿筛查，可及早诊断和阻断疾病发展，预防脑损伤的发生。国内由于筛查技术的滞后，新生儿疾病的筛查尚待普及。国内外资料表明开展和推广新生儿疾病的筛查，其经济意义和社会意义日益显著。随着中华人民共和国母婴保健法的颁布，对依法进行新生儿疾病筛查提供了有效的法律和政策支持。并且 TrFIA 法为卫生部新生儿疾病筛查质控中心推荐的首选方法 1。经过多年研究，我们建立了 Neo-hTSH TrFIA
10、法，并研制出了诊断试剂盒，现报道如下。1 材料与方法1.1 标本 标本均在受试者知情同意下通过 S&S903 滤纸收集，严格按要求操作 2-4，由郑州大学第三附属医院、沈阳市妇幼保健所新筛中心、佛山市顺德区妇幼保健院提供。1.2 材料与仪器 分别用于包被和标记的两株鼠源性促甲状腺素单克隆抗体（进口分装） ，TSH 纯品、牛血清白蛋白（BSA）和 Tween80（Sigma 公司） 。Sepharose CL-6B（Pharmacia 公司） 。96 孔微孔板（Thermo Labsystems 公司） 。铕(Eu 3+)标记试剂盒（Wallac 公司） 。-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的Eu3+发
11、光增强液 5、洗涤液 6和含有小牛血清(200ml/L)的 50mmol/L pH7.80Tris-HCl 溶液为分析缓冲液 6均为自制。其余试剂为国产分析纯试剂。冻干机（上海浦东冷冻干燥设备有限公司） 。VictorTM2D1420 型 TrFIA 检测仪及配套 DELFIA Neonatal TSH 试剂（Perkin Elmer 公司） 。恒温振荡仪（广州丰华公司） 。1.3 标准血片、质控血片制备 用 TSH 纯品按 50-55%的血细胞比容由人全血制备，由本公司生产部提供。1.4 固相抗体包被板的制备 将包被抗体用 50mmol/L pH4.6 柠檬酸缓冲液稀释至 3.00g/ml，
12、在 96 孔微孔板各孔中加 200l，4过夜，弃去包被液，洗涤 1 次，每孔加 280l 含有 10.0g/L BSA 的10mmol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液，37封闭 2h，弃去封闭液，真空抽干过塑冷藏。1.5 铕标记物的制备 将 1mg 的标记抗体加入含有 1mg 的 Eu3+冻干粉小瓶中，室温振荡反应 48h。反应液经用 50mmol/L pH7.80Tris-HCl 缓冲液平衡的 Sepharose CL-6B 柱（1cm40cm）层析，A 280监测收集第一洗脱峰。1.6 建立 Neo-hTSH TrFIA 检测方法 采用双抗体夹心法，将标准品、质控品或样本用打孔器打下直径约
13、3.2mm 样品盘于固相抗体包被板中，再加入用分析缓冲液 1：1200 稀释的铕标记物 200l 室温振荡4h（室温法）或室温振荡 15min 后置于 4过夜孵育再室温振荡 1h（过夜法） ，洗涤 6 次，加入增强液200l ，振荡 5min 后，于 1420 时间分辨仪上用随机配备的 Workstation 软件荧光计数和用 Multicalc软件进行拟合分析。1.7 Perkimelmer 公司 DELFIA Neonatal TSH 检测方法严格按仪器和试剂说明书操作检测。1.8 评价参数 评价试剂盒的分析灵敏度、分析特异性、准确性、精密度，建立试剂盒的参考值，并与国外同类产品进行比对试
14、验。1.9 统计学处理 Neonatal TSH TrFIA 标准曲线分析（有效剂量（ED） 、变异系数（ CV）等）及结果由 VictorTM2D1420 仪随机配备 Multicalc 软件自动给出。其它平行对照实验均采用配对 t 检验分析或直线相关性分析。测试值与靶值间采用偏倚分析。2 结果2.1 上述包被抗体浓度、包被与封闭温度与时间 7、反应温度与时间 7-8、铕标记物工作浓度、洗板次数等均采用棋盘方阵滴配法确定。2.2 方法学评价参数2.2.1 剂量反应曲线 采用 LIN-MEAS 拟合模式，绘制标准曲线如图 1。在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数 r 达 0.998
15、7。图 1 自制试剂盒剂量-反应曲线2.2.2 分析灵敏度 以自制试剂 1 U/mL 全血标准品重复检测 20 次，以 x +2s 的荧光值在曲线上得到相应浓度为检测低限，则本方法的检测低限可达 2.28U/ml。2.2.3 特异性 自制试剂检测含有 250U/L 的 hLH、250U/L 的 hFSH、100000U/L 的 HCG 样品，其表观值均小于 2.5U/ml。2.2.4 准确性与精密性 自制试剂盒检测 DELFIA Neonatal TSH 试剂标准品，实测值（10 次检测平均值）与标示效价比平均值为 1.05。取本公司制备的质控品 C1 和 C2，进行分析内 (10 次)和分析
16、间实验(10 次) ，分析内或分析间质控结果在靶值25%内，分析内 CV15%，分析间 CV20%。结果详见表1。表 1 自制 Neonatal TSH 试剂盒的精密性2.2.5 参考值 1690 例正常新生儿足跟干血片用自制试剂盒测定，Neonatal TSH 结果呈正偏态分布，结果详见表 2。经统计学处理，最小值为 0U/ml，最大值为 17.9U/ml，中位值为 2.03U/ml，平均值为 2.43U/ml，且 90%、95%、97%、99%、99.5%、99.9%的百分位数分别为5.07U/ml、6.22U/ml、7.02U/ml、9.18U/ml、10.59U/ml、15.07U/m
17、l。参照 99%百分位法并结合临床比对实验，自制试剂盒的筛查切值定在 9.5U/ml。表 2 1690 例正常新生儿足跟干血片用自制试剂盒测定的 Neonatal TSH 水平分布（U/ml）Neonatal TSH 含量（U/ml）例数 构成比（%） 累计频数 累计频率（%）0- 378 22.37 378 22.371- 457 27.04 835 49.412- 359 21.24 1194 70.653- 218 12.90 1412 83.55质控 靶值（uU/ml ） 接受范围 （uU/ml ） x 批内 （uU/ml） x 批间 （uU/ml） CV 批内 （%） CV 批间（%
18、） C1 13.4 10.1-16.8 13.71 14.29 7.12 7.82 C2 59.2 44.4-74.0 53.39 54.94 6.09 7.03 4- 103 6.09 1515 89.645- 81 4.79 1596 94.446- 43 2.54 1639 96.987- 18 1.07 1657 98.058- 15 0.89 1672 98.939- 6 0.36 1678 99.2810- 6 0.36 1684 99.6411- 2 0.12 1686 99.7612- 1 0.06 1687 99.8213- 0 0.0014- 0 0.0015- 2 0.1
19、2 1689 99.9416- 0 0.0017- 1 0.06 1690 100.0018- 0 0.0019- 0 0.0020- 0 0.0021- 0 0.002.2.6 临床比对实验 157 例标本（正常 125 例，阳性 32 例） ，同时采用自制试剂盒和 DELFIA Neonatal TSH 试剂盒检测,临床特异性为 100%，临床灵敏度为 100%，阴阳性符合率为 100%，约登指数为 1，回归方程为 Y=0.9523X-0.3159, r=0.9822。2.2.7 室间质评 2006-2007 年两年间参加全国新生儿筛查检验室间质评，共 6 次 30 个样本,经质评结果分析
20、，实测值均在可接受范围内（靶值30%） 。平均偏倚为 3.79%（-12.50%13.29%） 。3 讨论 目前已用于新生儿筛查的有酶免分析法、放射免疫分析法、免疫放射法、TrFIA 法、荧光酶免分析法和自动新生儿筛查系统等。20 世纪 80 年代初，我国开始在北京、上海、天津、沈阳等 8 大城市开展了 CH 的筛查，调查发现我国 CH 的发病率为 16255 9。TrFIA 法因灵敏度高、室间 CV 小，已被国内新筛实验室应用并成为优选方法 10，但国外试剂昂贵，检测成本高。自建的 Neonatal hTSH TrFIA 法灵敏度高可达 2.28U/ml，且在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应
21、曲线的相关系数 r 达 0.9987，与 hLH、hFSH、HCG 无明显交叉反应，分析内或分析间质控结果在靶值25%内，分析内 CV15%，分析间 CV20%，与对照试剂标准品进行准确性比对实测值与标示效价比平均值为 1.05，与对照试剂比对符合率一致，相关性系数 r 可达 0.9822，试剂盒室间质评能力比对成绩 100%，在国内自制试剂盒（TrFIA 法）率先获得准字号国食药监械（准）字 2005 第 3401233 号。自建的 Neonatal TSH TrFIA 微量检测法能满足临床应用需要，具有良好的临床应用价值。参考文献:1 田国力.上海部分地区新生儿筛查 18 年回顾J.中国预
22、防医学杂志,2004,5(6):484-485.2 Blood Collection on Filter Paper for Neonatal Screening ProgramsS.NCCLS,LA4-A4, 2003，7.3 中华人民共和国卫生部,卫生部关于印发新生儿疾病筛查技术规范的通知J.中华人民共和国卫生部公报,2005,1:44-50.4 陆俏梅,黄雪芳,陈冬梅,等. 新生儿疾病筛查血标本采集和运送中常见问题分析与对策J.妇产科护理,2006,12(7):1617-1618.5 乔艳红，谷泽亮，张湔，等.乙肝病毒表面抗体 TrFIA 方法的建立及其应用J.标记免疫分析与临床，200
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