1、I摘 要水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为约 40%的人口提供了主要食粮。虫害是造成水稻减产减收的主要原因之一。水稻虫害种类繁多，我国每年因虫害造成的产量损失占到水稻总产量的 5% 以上，给水稻的生产带来了极大危害。目前，我国控制水稻虫害最主要的方法是使用化学杀虫剂，但化学防治带来一系列问题，如环境污染，生产成本提高和食用安全性降低等。因此，通过培育自身能够抵抗虫害的水稻品种来防治水稻虫害无疑是最经济安全的有效策略。从已有的研究来看，仅依靠常规育种难以解决抗虫种质资源稀缺的问题，因此，通过基因工程手段导入外源抗虫基因，进而培育抗虫转基因水稻越来越受到人们的重视。近年来转 Bt 基因抗虫水稻已
2、经在生产上得到了广泛的应用，随着抗虫转基因水稻的大规模种植，Bt 基因抗虫谱相对狭窄及害虫易产生耐受性等问题相继引起了人们的关注。因此，从自然界中分离克隆出更多、更有效的基因成为解决这些问题的方法之一。籼稻是亚洲栽培稻的重要亚种，全世界水稻栽培品种中有 80%以上属于籼稻，其组织培养研究具有重要意义。而籼稻的组培特性普遍较差，再生率很低，导致一些生产上应用价值较大的优良品种转化仍然难以成功或转化频率低，因而研究优质籼稻的愈伤组织形成和植株再生能力对于遗传转化率提高十分必要。农杆菌介导法因具有转化拷贝数低等独特的优势，而广泛应用于转基因抗虫水稻研究中。然而，水稻不同品种间遗传差异性比较大，且转化
3、反应对水稻基因型依赖性强，从而增加了农杆菌介导的水稻遗传转化的复杂性和随机性。因此，通过对农杆菌介导的水稻转化体系的优化提高转化率十分必要。本研究主要进行了以下方面的工作：1. 在 新型 Bt 基 因 Cry30Fa1 和 Cry54Aa1 序 列 的 两 端 分 别 增 加 酶 切 位 点 序 列 ，送 基 因 合 成 公 司 合 成 ， 然 后 将 目 的 基 因 片 段 与 中 间 克 隆 载 体 pUPROK 分 别 进 行双 酶 切 ， 连 接 ， 获 得 含 目 的 基 因 的 中间载体。测序鉴定得到序列正确的阳性载体，用内切酶切下目的基因片段并插 pCDMAR-Hyg 载体，最终
4、获得高效表达双元载体pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg 与 pCDMAR-Cry54Aa1-Hyg，并通过酶切和测序的方法鉴定出上述载体的正确性。II2. 通 过 对 愈 伤 组 织 继 代 次 数 与 继 代 培 养 基 中 加 入 抗 坏 血 酸 （ Vc） 浓 度 的 优化 ， 调 整 愈 伤 组 织 生 长 状 态 ， 提 高 胚 性 愈 伤 组 织 数 量 。 结 果 表 明 R125 与 R818的 愈 伤 组 织 继 代 2-3 次 ， 分 化 率 最 高 ； 继 代 培 养 基 中 加 入 Vc 浓 度 为 40mg/L，能 减 少 愈 伤 组 织 褐 化 率 且 对 其
5、分 化 能 力 无 影 响 。3. 通 过 对 洗 菌 后 及 分 化 前 愈 伤 组 织 的 干 燥 处 理 ， 改 良 农 杆 菌 介 导 的 水 稻 遗 传转 化 体 系 。 结 果 表 明 洗 菌 后 进 行 干 燥 及 分 化 前 愈 伤 组 织 在 滤 纸 上 干 燥 2 天 ， 能够 加 快 分 化 速 度 ， 提 高 分 化 率 。4. 农杆菌介导法将外源基因 Cry30Fa1 与 Cry54Aa1 转入三系恢复系 R125 与R818 中，通过 PCR 检测与潮霉素溶液检测转基因植株。结果表明 Cry30Fa1 与Cry54Aa1 转 R125 未获得转基因阳性植株；Cry5
6、4Aa1 转 R818 也未获得转基因阳性植株；Cry30Fa1 转 R818 共获得 233 株转基因再生植株，经过潮霉素溶液检测和分子检测，其中 46 株为含目的基因的阳性植株。关 键 词 ： 籼 稻 ； Cry30Fa1 基因；Cry54Aa1 基因；抗 虫 ； 农 杆 菌 介 导 法IIIAbstractRice is one of the most important grain crops in the world, for about 40% of the worlds population taking it as their staple food. However，inse
7、ct damage is one of the main reasons to decrease the rice yield. There are a large variety of rice pests in China. The rice production loss is more than 5% of total yield because of insect damage. At present, the main method to control rice pest is to utilize chemical pesticides. However, it caused
8、a lot of problems, such as environmental pollution, higher production cost, food safety, etc. Breeding new rice varieties that produce insecticidal proteins by themselves is undoubtedly the most economical and security strategy. On the basis of previous reports, it is difficult to solve the problem
9、by traditional breeding because of rice germplasm resources are scarce. Given this, it is more important to use genetic engineering to breed resistant rice.In recent years, pest resistant rice with Bt genes in production have already been on a wide range of applications. With large-scale cultivation
10、 of insect-resistant transgenic rice, Bt gene zoophobous spectrum is relatively narrow and tolerance to pests and other problems have been attracted the attention of people. Therefore, separating and cloning new pest resistant genes from the natural world became more and more effective methods to so
11、lve these problems.Indica rice is a major subspecie of Asian cultivated rice, and more than 80% of the rice cultivars in the world belongs to indica rice, so it is important significance to study tissue culture. Tissue culture of indica rice is generally poor and regeneration rate is very low, causi
12、ng some production value on a large varieties of transformation are still difficult to successfully transform or frequency low. Therefore, the study of high quality indica rice callus formation and plant regeneration ability of genetic transformation rate is necessary.Agrobacterium tumefaciens-media
13、ted transformation has technique advantages including low copies, and is widely used in the study of insect-resistant transgenic rice. However, the relatively large genetic differences between different varieties of rice, and the transformation strong dependence on rice genotypes, increase complexit
14、y and randomness of the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in rice. Therefore, the optimization of Agrobacterium tumefaciens-mediated rice transformation system to IVimprove transformation rates is necessary.This research has the following main areas of work:1. Seqences of new Bt gene
15、s Cry30Fa1 and Cry54Aa1 that had been added cleavage site sequences at both ends, were sent to gene company to synthesis. Then all of target gene fragments and middle cloning vector pUPROK were cut separately by two enzymes and connected to form middle carriers of the target gene fragments. Positive
16、 vectors were got by sequences identification, and were digested by endonuclease to separate target gene fragments. Then target gene fragments were inserted into pCDMAR-Hyg vector to form eventual expression binary vectors pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg and pCDMAR-Cry54Aa1-Hyg. All of positive plasmids were id
17、entified by digestion and sequencing.2. By optimizing callus subculture time and different concentration of Ascorbic acid (Vc) in subculture media, callus growth state was adjusted and embryo callus were increased. Results showed that when R125 and R818 callus were subcultured 2 to 3 times, the diff
18、erentiation rate was the highest; Subculture media with 40 mg/L Vc could reduce the rate of callus browning with no effect on their differentiation capacity.3. By drying callus after washing Agrobacterium and before differentiation, the system of Agrobacterium tumefaciens mediated transformation was
19、 improved. Results showed that after washing Agrobacterium and before regeneration the caulls were dried 2days on filter papers, differentiation speed was accelerated and differentiation rate was increased.4. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of exogenous genes Cry30Fa1 and Cry54Aa1
20、into caulls of rice restorers R125 and R818, then identified gentic plants by PCR and Hyg B solution. As a result, R125 was no transgenic plants; R818 was only transformed into the gene of Cry30Fa1.There were 233 transgenic plants, but only 46 plants of them were transgenic plants identified by PCR
21、and Hyg B solution.Key words: Indica rice; Cry30Fa1and Cry54Aa1; Pest-resistant; Agrobacterium tumefaciens-mediated V缩写词(Abbreviation) 缩写名 英文名 中文名6-BA 6-Benzylaminopurine 6-苄基氨基嘌呤AS Acetosyringone 乙酰丁香酮2, 4 -D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid 2, 4-二氯苯氧乙酸bp Base pair 碱基对Ti Timentin 替曼汀Hyg Hygromycin B
22、 潮霉素B t Bacillus thuringiensis 苏云金芽孢杆菌NAA Naphthalene acetic acid 萘乙酸OD Optical density 光密度PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应Rif Rifampicin 利福平SDS sodium doaecyl sulfate 十二烷基硫酸钠EB Ethidium bromide 溴化乙锭Kan Kanamycin 卡那霉素KT Kinetin 激动素EDTA Ethylenediaminete-traacetic acid 乙二胺四乙酸VI目录摘 要 .1Abstract.3
23、缩写词(Abbreviation) .51.文献综述 .81.1 抗虫基因的种类及特点 .81.1.1 Bt 毒蛋白基因 .91.1.2 蛋白酶抑制剂基因 .101.1.3 植物外源凝集素基因 .111.1.4 淀粉酶抑制剂基因 .111.1.5 动物来源的抗虫基因 .111.1.6 其它抗虫基因 .121.1.7 抗虫基因存在的主要问题及解决策略 .121.2 水稻基因工程育种的技术体系 .131.2.1 构建嵌合基因 .131.2.2 选择转化载体 .141.2.3 选择转化受体 .141.2.4 转化方法 .151.2.5 转化体的筛选和转基因植株的分子鉴定 .161.3 农杆菌介导的水
24、稻遗传转化的研究 .161.3.1 农杆菌菌株与质粒载体 .171.3.2 农杆菌 Vir 区基因活性的诱导 .171.3.3 培养基成分 .181.3.4 愈伤组织的预处理 .181.3.5 农杆菌悬浮侵染环境 .181.3.6 共培养环境和时间 .181.3.7 共培养后农杆菌的抑制 .191.3.8 筛选标记基因以及筛选剂的选择 .191.4 转抗虫基因水稻 .201.4.1 转 Bt 基因水稻 .201.4.2 其它抗虫基因水稻 .201.5 转抗虫基因水稻安全性研究 .211.5.1 转抗虫基因水稻的食品安全性问题 .211.5.2 转抗虫基因水稻的生态安全性问题 .221.6 本研
25、究的立题依据与目的意义 .222.实验材料和方法 .232.1 实验材料 .232.1.1 供试水稻品种 .232.1.2 菌株和质粒 .232.1.3 培养基 .232.1.4 化学试剂 .242.1.5 重要仪器设备 .252.2 实验方法 .25VII2.2.1 载体的构建与鉴定 .252.2.2 重组质粒的农杆菌转化 .262.2.3 胚性愈伤组织的诱导及继代 .272.2.4 农杆菌介导的遗传转化 .272.2.5 转基因植株再生 .282.2.6 结果统计方法 .282.2.7 水稻叶片 DNA 提取 .282.2.8 水稻转基因再生植株潮霉素抗性检测 .292.2.9 转基因植株
26、的 PCR 检测 .293.实验结果与分析 .303.1 新型 Bt 基因含选择标记农杆菌转化载体的构建与鉴定 .303.1.1 含新型 Bt 基因中间载体 pUPROK-Cry30Fa1 与 pUPROK-Cry54Aa1 的构建与鉴定 .303.1.2 含新型 Bt 基因双元载体 pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg 与 pCDMAR-Cry54Aa1-Hyg 的构建与鉴定 .323.2 籼性水稻成熟胚愈伤组织的获得 .353.2.1 抗坏血酸对籼性水稻成熟胚愈伤组织获得的影响研究 .353.2.2 继代次数对籼性水稻成熟胚愈伤组织获得的影响 .363.3 农杆菌介导的转新型 Bt 基因籼性水稻的获得 .363.3.1 筛选压对愈伤组织转化率的影响 .373.3.2 干燥处理对愈伤组织分化的影响 .383.4 转基因抗性植株 T0 代的检测 .393.4.1 转基因抗性植株 T0 代离体叶片的潮霉素检测 .393.4.2 转基因再生植株 T0 代的 PCR 检测 .404.讨论与结论 .414.1 新型杀虫基因 Cry30Fa1 与 Cry54Aa1 的实际应用性 .414.2 籼稻愈伤组织的培养与转化体系的优化 .424.2.1 组织培养过程中的褐化问题 .424.2.2 愈伤组织继代次数对转化率的影响 .434.2.3 干燥处理对抗性愈伤组织分化的影响 .
