1、DNA重组技术实验原理、方法和步骤实验原理1DNA 重组技术 重组 DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和 DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤： 1）重组 DNA分子的构建：即将目的基因（DNA 或 cDNA片段）与载体 DNA重组，应用 TA克隆方法,将 PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了 PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq 酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一 A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一 T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在 DNA连接酶作用下，目的 DNA和载体
2、DNA连接形成重组DNA分子。 2）将重组 DNA分子转化宿主细胞。 3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组 DNA（TA 克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组 DNA的细菌。 4）收获扩增后的培养细胞，提取重组 DNA分子（质粒） ，并纯化，获得某一基因或 DNA片段的大量拷贝。图 1 TA克隆原理示意图2质粒 DNA的小量制备常见的质粒 DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在 PH 12.012.6碱性
3、环境中，线性的大分子量细菌染色体 DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA 仍为自然状态。将 pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体 DNA和蛋白质在去污剂 SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态。通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA 及蛋白质，质粒 DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒 DNA。3质粒 DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Comment 微微微微1: 格式固定：标题原理操作步骤注意事项 试剂货号公司。添加试验失败结果的照片。Comme
4、nt 微微微微2: 加入实验原理Comment 微微微微3: 关键的准备工作，如试剂选择等（提前预热/预冷相关仪器等）Comment 微微微微4: 注意事项附在相应操作步骤之后，以五角星标注。Comment 微微微微5: RNA防污染措施、型。型切点不固定，型其切割位点在识别位点之外，只有型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的 DNA片段，基因工程中所用的限制酶均为型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链 DNA分子上的特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断 DNA双链，形成一定长度和顺序的 DNA片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝
5、胶电泳检测，用已知相对分子量的线状 DNA（DNA 分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照，可以对重组环状质粒中的目的 DNA分子进行初步鉴定以下所有实验，进行前请认真阅读试剂使用说明书。一 RNA反转录 cDNA实验原理：RT-PCR 是将 RNA的反转录（RT）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA合成 cDNA，再以 cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的 cDNA序列。作为模板的RNA可以是总 RNA、mRNA 或体外转录的 RNA产
6、物。实验材料：试剂盒：Takara PrimeScript RT reagent Kit实验步骤：实验所用枪头，EP 管，水等全部使用 RNase free耗材，或者提前使用 DEPC处理。处理方式：按照 1/1000比例向无菌水中加入DEPC，将所需耗材在含 DEPC的水中浸泡过夜；次日早晨高压灭菌处理。提前调水浴锅至 42；Comment LD6: 设计引物时，保护碱基应加到 5-10个李积彬按下列组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行) 。5PrimeScript Buffer(for Real Time) 2 l PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5
7、l Oligo dT Primer(50 M) 0.5 l Random 6 mers(100 M) 0.5 l Total RNA 360ngRNase Free dH2O up to 10 ltotal 10l轻柔吹打均匀；室温放置 10min；42水浴锅中放置 1h；冰中冷却 2min；注意事项：上述反应可根据条件在 PCR仪中进行。当需要使用的基因编码的 RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将 RNA 溶液于 65C加热 5 分钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。二 目的基因扩增：引物设计原则：a) 特异性：在 cDNA中能且只能扩增出目的序列，不
8、会扩增出其他序列；（通过 blast检验）b) 在引物 5端添加酶切位点及 3个保护碱基；c) 酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点，尽量避免使用平末端位点；所选位点在扩增目的Comment LD7: 优化 PCR反应条件，使扩增的目的片段更为特异李积彬片段中不能出现，可以使用 primer premier对序列中的酶切位点进行分析。d) 设计引物时建议同时设计合成两对或两对以上引物，以免一对引物扩增失败时，再合成第二对引物浪费时间。三 PCR反应：实验原理：PCR 技术的基本原理 类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变
9、性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板 DNA的变性：模板 DNA经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA双链或经PCR扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板 DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链” ，而且这种新链又
10、可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。实验材料：dNTP,PCR buffer,DNA 聚合酶，上游引物，下游引物，纯水，模板。操作步骤：拿到新合成的引物后，按照引物说明书离心，溶解引物至100Mm。使用时稀释至 10mM。将（Tm-5）作为退火温度进行Comment 微微微微8: Comment 微微微微9: 对于在细胞系中突变可能性比较大的基因，可以考虑将多种细胞系的 RNA或 cDNA混到一起作为模板进行扩增。mRNA不同剪接体的选择，根据文献中报道的以往研究
11、来选择自己要研究的剪接体。使用的模板需经过质量鉴定，比如进行琼脂糖凝胶电泳鉴定片断完整性。PCR反应并对 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。如果存在非特异条带，一般会设置退火温度梯度，摸索最适退火温度。 （Tm-5）不是一个普适的规律，最好不要太依赖。4k以下的片段使用 KOD Plus DNA 聚合酶，4k 以上选择 KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作即可；如果 4k以下的片断用 KOD Plus扩增效果不佳，可以换用 KOD FX。四 PCR产物回收：实验原理：在高盐状态下，纯化树脂专一性地吸附 DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA 被洗脱下来。实验材料：OMEGA cycle-p
12、ure kit,OMEGA gel extraction kit取 5微升 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，如果产物为单一条带，且大小符合预期，直接进行 PCR产物回收。如果存在非特异条带，可以考虑进行胶回收，或者继续优化 PCR反应条件。配制 1%琼脂糖凝胶：称取一克琼脂糖，加入 100ml TAE溶液中，煮沸至凝胶完全溶解。待温度降至 60C左右时(刚好不烫手)加入 10l 4S green，摇匀，将凝胶溶液倒入槽内，冷凝后备用。将反转录样品与 Loading Buffer混匀，加入凝胶孔内，最右端加 Marker，固定电压 180V，跑 20分钟左右。此时调水浴锅60C .操作步骤：参
13、考意见：500bp 以下的片段使用 2%琼脂糖凝胶；500bp 以上使用 1%琼脂糖凝胶。标准并不绝对，可以根据个人经验进行调整。在紫外灯下切下相应大小的 DNA片段，加入 EP管内，按照 0.1g凝胶加入 100l 的比例加入 buffer xp，放入 60C 水浴锅中至胶完全融化。这段时间组装收集管与吸附柱，并在吸附柱上做好标记。紫外照射时间不宜过长，避免 DNA形成 TT二聚体。用大枪将 EP管内溶液吹匀，吸入吸附柱中，12000rpm 离心1min；倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入 300l buffer XP，最高速离心 1min，倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入 700l wash
14、 buffer，最高速离心 1min；重复上一步骤。最高速空转 2min；取出吸附柱，放入新离心管中，70加热 2min，待乙醇挥发；向吸附柱中加入 50l 超纯水，70加热 2min，12000rpm 离心1min，离心管内液体即所需回收的 DNA溶液。五 PCR产物与载体的酶切实验原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:类、类、类。类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于 ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而类酶在识别位点上切割 DNA分子，然
15、后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序Comment 微微微微10: 实验中发现快切酶切割效率低的现象。如果可以找到合适的 buffer，建议用常规酶进行酶切。酶切部分写详细。列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为 4至 6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的 DNA段(如 Sma :5
16、-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的 DNA段称粘性未端，如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC33CTTAAG 5 3 CTTAA G5DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受 RNA或单链 DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须
17、首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加 0.1倍体积 3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70低温冰箱 30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。操作步骤：使用 takara quick cut限制酶或常规限制酶，酶切体系及条件见相应酶的说明书。Buffer 5l Buffer 5l酶 1 1l 酶 1 1l酶 2 1l 酶 2 1l载体 1g 外源片段 1g水 补至 50l 水 补至 50l温度根据所用不同酶确定，反应时间一般 10min。注意事项：双酶切时，两种限制酶反应温度不一致时，可
18、以采用两种方法解决：1 向体系中加入两种限制酶，先在低温下进行反应，再用较高温度下进行反应2 先加入一种限制酶，使用相应反应温度进行反应，再加入第二种酶，使用第二种酶的温度进行反应双酶切时，两种限制酶反应 buffer不一致时，可以采用两种方法解决：1 进行两次酶切，两次酶切之间回收 PCR产物；2 先使用盐离子浓度较低的 buffer进行第一次酶切，然后加入相应的限制酶和盐离子，继续进行第二次酶切。六 连接：实验原理： DNA 连接酶催化相邻的核酸分子间 3 -羟基和 5-磷酸基形成磷酸二酯键.当两条单链的寡核苷酸与同一条靶序列完全互补配对时,DNA 连接酶可催化一条寡核苷酸 3 -羟基末端
19、和另一条寡核苷酸 5-磷酸末端通过磷酸二酯键连接；如果一条寡核苷酸 3 -羟基末端的碱基出现了突变错配,DNA 连接酶就连接不上,不催化磷酸二Comment LD11: 制备高效率的感受态对实验成败十分关键李积彬酯键形成.实验材料：NEB DNA ligase体系中外源片段与载体的分子数比例控制在 1:11：10 之间。对于长约 5K的载体，一般加入 100ng，对于长度为 nKb的外源片段，加入（20n200n）ng。体系中其余成分参考相应酶的说明书。七 转化：实验原理：细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒 DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于
20、 0，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA形成抗 DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热击处理，促进细胞吸收 DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如 Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。实验材料：小枪，小枪头，大枪，大枪头，1.5mlEP 管，固体 LB培养基，无抗性的液体 LB培养基操作步骤：超净台内放入小枪，小枪头，大枪，大枪头，1.5mlEP 管，固体LB培养基，无抗性的液体 LB培养基，紫外照射超净台 30min，同时调水浴锅至 42，同时制冰。
21、以下操作如无特别说明，建议均在冰上进行；从-80冰箱内取出感受态细菌，冰上融化（可以室温融化或在手中捂化，不推荐） ，融化后立即将感受态分装至 EP管中，每管约 30-50l，置于冰上；吸取 5-10l 转化体系，放入感受态中轻柔吹打数次混匀，做好标记；将 EP管置于冰上 30min；将 EP管置于 42水浴锅中加热 90s，期间尽量不要扰动 EP管；取出 EP管，置于冰上 2min；向 EP管中加入 400800l 无抗性 LB液态培养基，摇床内100rpm，37摇 45min；将 EP管内培养基倒到固体 LB培养基上，晃动培养基，使菌液在平皿表面分布均匀；也可采用涂布法和划线法。三种方法各
22、有优势，个人比较习惯第一种方法；固体培养基有抗性，抗性的选择根据质粒情况而定；培养箱内 37倒置培养过夜；12-16h后，即可看到固体培养基表面长出单个菌落。TOP10 十个小时八 挑取单克隆摇菌超净台内放入小枪，小枪头，移液管（可选） ，大枪，大枪头，大试管，试管架，有抗性的液体 LB培养基，紫外照射超净台30min；向大试管中加入含相应抗性的 LB液体培养基适量一般 4ml或其整数倍。取培养过夜的 LB固体培养基，用小枪头挑取单个菌落，将枪头投入大试管中，做好标记，盖好盖子；挑取时宜选中等大小的菌落，太大太小均不宜挑取；Comment 微微微微12: 添上试剂盒货号。有时一个大菌落周围会有
23、几个小菌落围绕大菌落而生，此时优先选择这种大菌落，一定不能挑取周围的小菌落；37摇床内振荡过夜，转速 220转/min。一个板子上挑取 8-10个克隆。注意事项：Amp 在 37摄氏度下过夜培养后失效，不能再用。九 质粒提取（翻译 omega质粒提取试剂盒说明书）实验原理：当菌体在 NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与 DNA发生变性，当加入中和液后，质粒 DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体 DNA不变性 而呈絮状，离心时可沉淀下来。操作步骤：取振荡过夜的菌液，分装至 4ml离心管中，做好标记；一定一定要做好标记！室温下，10000g 离心 1min；向
24、4ml离心管中加入 250l solution I，吹打均匀，将菌液转移至 1.5ml离心管中，吹打均匀。可以在 1.5ml离心管中插入牙签，在 votex上涡旋振荡一定要使细菌重悬均匀；向离心管中加入 250l solution II，轻柔颠倒 EP管 6-8次，使菌液变澄清裂解时间控制在 5min以内；不可剧烈吹打涡旋等；向离心管中加入 350l solution III，迅速颠倒混匀；一定要迅速、彻底混匀；加入 solution III后立即混匀，防止出现局部沉淀；室温下 13200rpm（最高转速）离心 10min；此段时间将吸附柱插入收集管，做好标记；吸取离心后的上清液，加入吸附柱中
25、；动作要轻柔，不要吸起沉淀；如果上清液中出现沉淀室温下 10000g离心 1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入 500l Buffer HB，室温下 10000g离心 1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入 700l Wash Buffer，室温下 10000g离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；重复上步操作；最高速空转 2min；此步骤不可省略；取出吸附柱放入干净的 EP管中，敞盖 70加热 2min；向吸附柱中加入 60l Elution Buffer（具体体积根据质粒可能的产量调整） ，闭盖 70加热 2min；室温
26、下 10000g离心 1min；测量质粒浓度与 A260/A280值，标记于管壁，-20保存。浓度超过 1000ng/微升时，将质粒溶液稀释后再测。调零溶液建议使用溶解 DNA的溶液提取质粒后，取约 2微升进行电泳鉴定，观察有无细菌基因组DNA污染。十 鉴定：鉴定一般采取酶切的方式。用构建载体时所用限制酶对提取的质粒进行酶切，电泳。如果载体构建成功，电泳结果会显示两条带，一条与空载体大小相同，另一条与插入片段大小相同。操作与前述相同可以在插入片断上和载体上分别选择酶切位点进行酶切。鉴定插入片断正确的质粒，再次转化摇菌，得到的菌液加入 50%甘油，1ml 分装，-80 摄氏度保存。每个载体可以保留 5-6管菌种。
