1、一、miRNA 简介小 RNA 是 1928nt 的调控 RNA 分子，主要包括微 RNA(micro RNA，miRNA)和小干涉RNA(short interfering RNA，siRNA)两类，其中的 miRNAs 成为继 siRNAs 之后新的研究热点之一，名列 2002 年和 2003 年美国科学杂志评出的年度十大科学成就。miRNAs 是长片段 RNA 序列的一部分，同 siRNAs 一样是比较短小的单链小分子 RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由大约 70 nt 大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标 mRNA 分子的 3 端非编码区域(3-untranslat
2、ed region，3 UTR)互补导致该mRNA 分子的翻译受到抑制。在 miRNA 公共数据库 miRBase (http:/www.mirbase.org/)中已经有 1W 多条来自不同物种的miRNA 序列。MiRNA 检测方法要了解 miRNA 在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测miRNA 基因的表达。因此， miRNA 表达水平的检测也成为了科学家们研究的热点。但是由于小分子 RNA 是一类很小的分子，部分小分子 RNA 表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。常用的检测方法有：1.1 Northern blotting 1.2 核糖核酸酶
3、保护分析以及基于此方法的液相杂交。1.3 RT-PCR 也被用来检测 miRNA 前体的表达水平， 其他基于 PCR 技术检测 miRNA 的方法有：引物延伸法，就是在引物的 5 末端加一个特异标记，可以定量测定低丰度的 RNA含量；原位杂交技术（CISH,FISH）可以方便的检测 miRNA 的时空表达的差异。1.4 芯片(microarrays) 技术46,47是一种较快的研究 miRNA 表达的方法。 二、反转录引物分类以及设计原理Real-time PCR 方法克服了由于 miRNA 分子太短（22 nt）带来的定量最大难题而引入靶向特异性的反转录引物，该 RT 引物可以与成熟 miR
4、NA 结合，形成反转录引物/成熟miRNA 复合物，并在 miRNA 的 5末端延伸。这样就得到一个较长的反转录扩增因子，为进一步做实时定量 PCR 提供了符合要求的摸板。RT 引物有两种类型：1、 Oligod(T)特异的 RT 引物（QIAGEN 产品为主）由特异序列(T)20 左右兼并碱基 V 或 VN 组成。 （所有 miRNA 可以公用一个 Oligod(T)的 RT 引物，但是 RNA 在反转录前需要进行末端 Poly(A)加尾）2、茎环状结构的 RT 引物（ ABI 产品为主）由可以自身呈环茎状的特异序列6 到 8 个 miRNA3端反向互补碱基组成。(一条 miRNA序列特异对
5、应一个茎环状结构的 RT 引物） 。三、引物探针设计由于反转录后得到的 cDNA 为（miRNA+RT 引物）复合片段。上游引物可以在 miRNA 自身序列上找，如果 GC 含量太低，可以在上游引物 5端加入GCGCC 等的保护碱基；下游引物在 RT 引物的反向互补序列中找；也就是说：上游引物是每个 miRNA 所特有的，下游引物为通用引物就可以了。荧光定量 PCR 检测方法有 SYBR Green 染料法和 TaqMan 探针法。前者需要调整引物浓度以及引物扩增效率，把引物二聚体调整到越小越好；探针法则需要设计荧光探针，这其中由于 MGB 探针需要碱基数量少和特异性好的特点而被推荐（非广告）
6、 。探针设计位置有 3 个：完全与 miRNA 序列相同、在 miRNA 与 RT 引物的交叉点、完全在RT 引物上；这其中又有正向和反向互补两种情况。至于探针要设计在那个位置，根据自己试验情况而定，本人以为效果都差不多。四、试验操作流程1、RNA 提取在以上两种 RT 引物中，Ologod(T)特异引物所需要的 RNA 尽量是用特殊试剂盒提取的小RNA，而茎环状结构 RT 引物需要 RNA 正常提取就好。另外由于所需样本不同 RNA 提取方法也不完全相同，普通组织样本和细胞可以研磨用Trizol氯仿抽提；血液和植物样本需要前期处理后再用 Trizol氯仿或用专门的 Kit 抽提。2、反转录确认用 Oligod(T)特异 RT 引物时，RNA 需要进行 3Poly(A)加尾处理。反转录的酶没有特殊要求，操作请按照各自反转录酶的说明书进行就好。这里特别注意的是：反转录过程中用到的 RT 引物（常规的是随机引物、Oligod(T)和特异引物）是前面提到的 Ologod(T)特异引物和茎环状结构 RT 引物，它们分别属于 Oligod(T)和特异引物范畴，在反转录中不需要另外添加其他 RT 引物。在确定反转录温度中请特别注意您使用的是哪一种 RT 引物，而设定相应的反转录温度。3、荧光定量 PCR优化 PCR 体系（引物浓度、 Mg 浓度、dNTP 浓度、退火温度等） ，正常操作。
