1、1拼接和修复操作流程一 ：拼接1、引物登记：新引物到时，认真核对引物条数，按照基因名详细记录在引物登记本上。2、溶引物：将引物按顺序隔排排放到 96 孔平板上， （注意将 GR 基因两条重复的首尾引物各取出一条）向每管引物中加入 300ul1*TE，并在每管管盖上标记出基因名称和引物序列号，注意不要错标。测序引物单独拿出来，交由测序人员保存，用时再溶解。3、振引物：将每板引物用涡旋震荡器震荡均匀，每板引物震荡时间不少于 2 分钟。4、写拼接方案：根据每条基因的引物条数对其进行分段，每段引物在 12-18 条之间，标示出各段的基因长度，并依据基因的平均 Tm 值以及 GC%选择一个合适的 退火温
2、度。一般退火温度稍高于平均 Tm 值，并根据 GC%进行调整。若 GC%大于 60%时，要适量加入 DMSO，最后写好基因的重叠延伸方案。5、混引物：按照拼接方案的分段方法，对各段引物进行混合，每条引物取 5ul 混合于 1.5ml 离心管中，充分震荡，混合均匀。6、准备反应：找到各段的首尾引物，按顺序与混合引物排列好，准备好一管灭菌水和总管。总管配置方法如下：5*pfu Buffer 10ul * 40 400ulpfu DNA 聚合酶 0.6ul 24uldNTP 1ul 40ulH2O 13.4ul 540ul注意配置总管是要确保每个成分的质量，每次新领取的成分用之前要检测。7、预扩增反
3、应：反应体系如下： 反应程序下：混合引物 3ul 1、 94 2min2、 94 20s3、 退火温度+4 20s总管 25ul 4、 72 14sH2O 22ul 5、 94 20s 6、 退火温度 20s7、72 14s - 8、 94 20s9、 55/60/65 20s10、 72 14s11、 72 2min注意：配好反应体系后要离心，确保 PCR 管中没有气泡。如有气泡会影响 Pfu 酶的活性。其中 2-4 号程序是个降落 PCR（Touch down PCR）每个循环退火温度下降 1 度，运行 4 循环，5-7 号程序,运行 8 个循环， 8-10 号程序，运行 8 个循环。其中
4、延伸温度根据片段大小决定，pfu 的聚合速度为 1kb/30s8、二次扩增反应： 2反应体系如下： 反应程序如下：预扩产物 1ul 1、 94 2min 首引物 2ul 2、 94 20s尾引物 2ul 3、 55/60/65 20s 总管 25ul 4、 72 视片段大小设定H2O 20ul 5、 72 2min2-4 号程序，运行 18 个循环9、二扩产物检测：取 2ul 二扩产物进行电泳检测，若二扩产物有很好的纯度和浓度，可直接用其做模板进行下一步的重叠延伸。若二扩产物纯度不够，则需要对其进行胶回收，回收完后做模板。若二扩产物浓度不够但很单一则需检测其首位引物的浓度。若二扩产物浓度及纯度
5、都不好则考虑更改拼接方案。对拼接好的片段作好标记，对不理想的片段作好记录。10、第一轮重叠延伸：反应体系如下： 反应程序如下：预扩产物 1/2 各 1ul 1、 94 2min 首引物 2ul 2、 94 20s尾引物 2ul 3、 55/60/65 20s 总管 25ul 4、 72 视片段大小设定- H2O 19ul 5、 72 2min2-4 号程序，运行 18 个循环11、对重叠延伸产物跑回收胶，对其电泳情况进行记录，对好的片段进行胶回收。12、以回收好的第一轮重叠延伸产物为模板，做下一轮重叠延伸，直至得到全长。二：基因修复1.基因修复的过程：（1）一般早上 9：3010：30 之间，
6、办公室下修复方案。修复方案下后，首先用修复方案本（不用修复本，因为在将方案誊写至修复本上时有一定出错率，直接用修复方案本可以保证不拿错质粒等）找到所需的原始质粒和所需基因的引物板。放于自己实验桌上。然后将方案誊写于修复本上（注意写好片段大小） 。（2）将原始质粒稀释 20 倍。首先写好稀释质粒 EP 管的编号（标明 1：20） （原始质粒一般用 mark 笔的粗头写，所以我们稀释质粒最好用 mark 笔的细头写，以便区分） 。然后分别吸取原始质粒 2uL 至对应空管中，再加入 38uL 的无菌水（水要将原始质粒冲至管底） 。最后在振荡器上振荡一下。（3）利用修复本将首尾引物排好顺序,至于板上。
7、然后将稀释质粒相应的排好（同时核对是否出错） 。写好 PCR 管，相应把引物和质粒加于相应 PCR 管中（稀释质粒、首末端引物各 2mL） 。加入 25uL 的总管。最后用无菌水将其配成 50uL 体系。（4）上 PCR 仪：因为各台 PCR 仪功效不一样，运行时间长短可能悬殊比较大。 ，所以尽量一批 PCR 都在一台机器上运行 (一些难做的基因除外） 。其 GC在 40和 60%之间的可以直接用 60 度退火；GC在 60左右的片段，可以加入 1uLDMSO（DMSO 毒性极低，是一种水溶性的化合物，能溶解绝大多数有机化合物，减少 DNA 的二级结构，降低退火温度）在 60 度上退火，或直接
8、在 65 度上退火；GC在 65或更高一点的片段，可以加入 2uL 的 DMSO 在 60 度上退火，或加入 1uLDMSO 在 65 度上退火；对于 GC达到75左右的基因可以加入 2/3uLDMSO（DMSO 最多可加至 3uL，再多的量将逐渐抑制反应）在 68 度或 65 度上退火，有些基因甚至可以用 70 度或 72 度退火；GC%在 40或更低的片段，可以在 55 度上退火，有些更低 GC的，可以至 50 度退火。新 pfu 酶活性为每 30S 合成 1kb 片段，据此，设置延伸时间。3程序是1 94 度 2min2 94 度 20s3 设定的退火温度值 20s4 72 度 13s5
9、 72 度 3min2 至 4 号程序跑 18 个循环（5）胶回收：在 PCR 产物下来之前须注意一下是否有回收胶。PCR 产物下来后在板上排好顺序，加入一点 loading buffer，拿好胶，进行点样。点样时尽量减少损失。在胶跑好前，写好 2mL 的 EP 管。胶跑好后，核对片段大小，割胶（胶需割得较薄，以保证没有杂带混入） ；加入 450uL 的溶胶液（即使胶非常厚 45mL 已经足够，加入过多的溶胶液，在下面的步骤中容易引起污染）放入 63 度下水浴；写好套管和 1.5mLEP 管并排序（注意不能写错管子和弄错顺序） ；在观察胶已溶好后，将其转至套管中，并其按顺序排在离心机上；300
10、0r/min（相对于 5000r/min 其更利于 DNA 的吸附） ，1 分钟；10000r/min，30S（很关键，时间太短可能会导致 DNA 中残留溶胶液，影响测序反应，时间太长可能导致少量 DNA 损失） ；倒掉溶胶液，加入漂洗液，5000r/min，1min；倒掉，再漂洗一次；倒掉漂洗液后，10000r/min，1min(关键步骤，时间太短会引起酒精残留，影响后续实验） ；将套管转至1.5mL 的管中，放入烘箱，3 4min；取出，加入 30uLTE（加至管底，而不是打在管壁上） 。（6）继续做下一轮 PCR，直至得到所需基因全长。（7）模板、原始质粒、稀释质粒和修复引物的整理：原始
11、质粒用已写上日期的小袋装好，放于冰箱中；稀释质粒和模板按照日期排序于 96 孔板上，约一个月以前的东西整理倒袋子中。这样只要查一下修复本和修复方案本就可以迅速找到所需东西。一般一个月内的东西十分钟内能找到，一个月以前的东西半小时内能找到。（8）基因进度整理：修复方案本上的方案在其被誊写到修复本上时，在此方案前打勾，在此方案被完成后，用红笔在其右侧标上连接编号和日期（以保证没有漏做的基因） 。每天中午时候观察平板生长情况，如遇不好情况，采取相应措施；对于难做的基因尽量多花时间，尽快做完，从而不影响基因的整体进度。一般的修复方案尽量在当天就完成，最迟第二天，必须完成。2.修复中可能出现的问题以及注
12、意事项（1） 看胶时出现一系列异常情况：所有片段都没有出，或只有个别片段有很弱的带，说明总管有问题，或个人实验中出错；一条基因的全部片段都没有出，可能是原始质粒拿错，或退火温度不对；一条基因的部分片段没出，说明此基因的部分引物不好、原始质粒（一般原始质粒都好用）不好，或该基因的此片段处于 GC 高峰或低谷处，也有可能东西拿错；杂带呈现几条比较清晰的带，可能是模板加入量太多或两模板加入的量悬殊太大；杂带呈现为，主带上面弥散呈一片，说明该基因重复序列严重。（2）对于难扩的基因：基因中存在 GC%高峰或低谷的片段，可以单独拿出来用更高或更低的温度退火（强行做的话，可能会出现缺段现象） ；GC%含量很
13、高，可以用 68 度、70 度甚至 72 度退火，同时加入适量的 DMSO；GC% 含量很低的基因可以在 55 度或 50 度上退火：对于一些易出杂带并且较弱的基因可以多跑上一些循环（较常用)，或者做 2 管回收时并在一起（一般情况下不用此方法,因为弱带很可能并不是比较纯的目的片段） ；对于重复序列严重的基因，首先要大量稀释模板，有些可以稀释至 500 至 1000 倍（能减少杂带出现几率） ，其次需要提高退火温度（减少非特异性扩增） ，并且严格限制延伸时间（延伸时间需正好卡在目的片段延伸所需时间的点上)。4三：连接扩增，当一个基因的 GC 含量位于 40%-60%之间时，我们可以通过拼接直接
14、将基因的片段分小段直接拼出全长，如果该基因 GC 含量过高或过低，或有比较严重的重复序列时，我们就要考虑用连扩将这条基因分小段拼出，一旦小段出来，就能重叠延伸得出该基因的全长。我们在做连接扩增前先提一下 Taq DNA 连接酶的功能，Taq DNA 连接酶能够催化磷酸二酯键的形成，使杂交到同一互补靶 DNA 链上的两条契合寡核苷酸链的 5“磷酸末端和 3“羟基末端通过形成磷酸二酯键连接。这个连接反应只有当两条寡核苷酸链和互补靶 DNA 链完全配对并且两者之间没有空隙的条件下才可发生。这正好符合我们基因的设计引物的原则，在 45 度到 65 度的范围内，Taq DNA 连接酶均有活性。连接扩增的
15、步骤可以分为以下三步1. 磷酸化过程一般定 20 ul 的反应体系。将分好小段的基因的引物按奇偶分开磷酸化，如 1，3，5，7，9，11，13 号引物各取2ul放入 200 ul 的 PCR 管中，2，4，6，8，10，12，14 号引物各取 2ul 放入 200 ul 的 PCR管中，再依次加入ATP 2ul, 浓度为 1m Mol/LPNK buffer A 2ul,PNK 0.4ul加水定容至 20ul。置于 37 度的恒温箱中静置 30min2，连接反应一般定 25ul 的反应体系，依次加入奇数管已磷酸化好的反应物 5ul偶数管已磷酸化好的反应物 5ulTaq DNA 连接酶 buff
16、er 2.5 ulTaq DNA 连接酶 0.2-0.3 ul加水定容至 25ul。我们用的 Taq DNA 连接酶是 New England（纽英伦）公司的高浓度的 Taq DNA 连接酶，浓度为 40U/ ul，一般情况下加 0.2 ul 足以，如果做得连接扩增比较多时，即大于3 个，建议配个总管。然后上 PCR 仪连接反应的程序是94 度 2min每秒钟下降 0.02 度直至下降至设定的连接反应温度值。维持在你设定的连接温度 30min连接温度的设定一般我们参考该基因的平均的 GC 含量，最低的 Tm 值和平均的 Tm 值，设定值一般在 45 度到 65 之间，在 45 度到 65 度的
17、范围内，Taq DNA 连接酶均有活性。如果一次做多个连扩，我们可以设一个比较低的连接温度值，我们先要考虑到所有引物都能够退火。 3，扩增反应一般定 50 ul 的反应体系5连接反应物 5 ul首尾引物各 2 ul总管 25 ul加水补足至 50 ul再看看该基因的平均 GC 含量和平均 Tm 值。如果是高 GC 含量和高平均 Tm 值的基因片段考虑加入 1-2 ul 的 DMSO，有助引物的退火和 Pfu DNA 聚合酶通过高 GC 区。再上 PCR 仪，程序是1 72 度 2min2 94 度 2min3 94 度 20s4 设定的退火温度值 20s5 72 度 13s6 72 度 3min3 至 5 号程序跑 20 个循环片段下来检测其亮度。
