1、分子生物学一、名词解释1、分子生物学（Molecular Biology）：从分子水平研究生命本质和生物学规律为目的的一门学科。从广义上讲，蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能的研究都属于分子生物学的范畴，也就是从分子水平阐明生命现象和生物学规律。从狭义上讲，分子生物学是偏重于核酸或基因的分子生物学，主要研究基因或 DNA 的复制、转录、表达和调节控制等过程。2、限制性内切酶（Restriction enzyme）：识 别 并 切 割 特 异 的 双 链 DNA 序 列 的 一 种 内 切核 酸 酶 ， 它 们 仅 切 断 特 定 序 列 中 的 磷 酸 二 酯 键 。3、Alu 家族：是 中
2、度 重 复 序 列 的 一 种 ， 具 有 种 特 异 性 ， 可 用 于 区 分 不 同 的 哺 乳 细 胞 。Alu 家 族 每 个 成 员 的 长 度 约 300bp， 每 个 单 位 长 度 中 有 一 个 限 制 性 内 切 酶 Alu 的 切点 （ AGCT） ， Alu 可 将 其 切 成 长 130bp 和 170bp 的 两 段 。4、DNA 物理图谱：就是 DNA 的限制酶切图谱，指 DNA 链的限制性酶切片段的排列顺序，即酶切片段在 DNA 链上的定位。5、 DNA 的变性 (denaturation)：当双螺旋 DNA 加热至生理温度以上（ 94-95）时，失去生理活性
3、，DNA 双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规线团，这一过程叫做 DNA 的变性或融解。6、DNA 的复性：热变性的 DNA 如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋，这叫做复性。7、核酸探针（probe)：指带有标记物的已知序列的核酸片段。8、Tm 值：通常将 50%DNA 分子发生变性的温度称为解链温度，用 Tm 表示。9、增色效应：在 DNA 的变性过程中，它在 260nm 的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升，故称为增色效应。10、分子杂交：不同来源的多核苷酸链间，经变性分离，退火处理后，若有互补的碱基顺序，就能发生杂交，形成 DNA-DNA，甚至可以在
4、DNA 和 RNA 间进行杂交，形成 DNA-杂合体。11、Southern blot：DNA DNA 杂交，是进行基因组 DNA 特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的 DNA 片段，将胶上的 DNA 变性并在原位，将单链 DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定 DNA分子的含量。12、Northen blot：DNA DNA 或 RNARNA 杂交。Southern 杂交相似，Northern 杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的分离开来，随后将其
5、原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的或探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影） ，以目标所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标 RNA 在所测样品中的相对含量，与Southern 杂交不同的是，总 RNA 不需要进行酶切，即是以各个 RNA 分子的形式存在，可直接应用于电泳。1977 年由 Alwine 提出来，成为分析 mRNA 的经典方法。13、假基因：与 真 基 因 在 核 苷 酸 顺 序 的 组 成 上 非 常 相 似 ， 具 有 高 度 同 源 性 ， 但 由 于 突变 不 能 表 达 ， 没 有 正 常
6、功 能 的 基 因 。14、拓扑异构酶：细胞内存在的一类能催化 DNA 拓补异构体相互转化的酶。15、反转录酶：以 RNA 为 模 板 指 导 三 磷 酸 脱 氧 核 苷 酸 合 成 互 补 DNA（ cDNA） 的 酶 。16、Chargaff 规律：Chargaff（1949）从不同来源 DNA 测定出 4 种核酸碱基，即胸腺嘧啶T、胞嘧啶 C、腺嘌呤 A 和鸟嘧啶 G，腺嘌呤和胸腺嘧啶的量和鸟嘌呤与胞嘧啶的量并不相等，即（A+T）/（C+G）的比值随不同来源的 DNA 而有所不同，他发现鸟嘌呤的量与胞嘧啶的量总是相等，腺嘌呤与胸腺嘧啶的量相等，即 G=C，A=T，这个规律称为Charga
7、ff 规律。17、蛋白质的一级结构：是指蛋白质中共价键连接的氨基酸残基数目、组成和排列顺序包括二硫键的位置。18、蛋白质的二级结构：指多肽链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。天然的二级结构包括 -螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲。19、蛋白质的三级结构：指多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象相互作用进一步盘曲折叠形成具有一定规律的三维结构。其稳定主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐键及范德华力等。DNA 的局部构象：双螺旋的许多结构参数是随碱基序列的不同而在一定范围内变化的。20、蛋白质的四级结构：指由多肽链（三级结构）靠静电性质的力相互聚合而成特定构象的分子。21.
8、 DNA 高级结构：指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA 高级结构的主要形式，可分为正超螺旋、负超螺旋，特殊情况不可相互转变。22、DNA 一级结构：指 4 种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该 DNA 分子的化学构成，由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故可称为碱基序列。23、DNA 二级结构：指两条多反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。24、Western blot：一般称为蛋白质印记，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在
9、所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。25、质粒：是细菌中的另一类遗传物质。质粒是环状的 DNA，能自我复制，它们存在于染色体之外二、填空1、 Pol I 除了聚合酶活力外，还具有 35核酸外切酶活力和 5 3核酸外切酶活力。当以枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理时，Pol I 就裂解为大小不同的活性片段。较大的C 端片段(残基 324928)具有 聚合酶和 35核酸外切酶活力，也称为 Klenow 片段。较小的 N 端片段(残基 1323)具有 5 3核酸外切酶活力。2、总 RNA 的提取（）试剂法提，DNA 在体内通常都与蛋白质相结合，蛋白质对 DNA 制品的污染常常影响到以后的 DNA 操作过
10、程，因此，需要把蛋白质除去。在所有 RNA 操作中，凡接 RNA 的器皿必须严格消毒溶液中必须加入 RNA 酶抑制剂，如 Rnasin。氧钒基-核苷复合物、异硫氰酸胍等，所用溶液和水一般先用（）处理，在经高温灭菌。在所有RNA 操作中，操作者必须戴手套。3、核酸可分为 DNA 和 RNA，RNA 可分为 mRNA、tRNA、和 rRNA 三种。4、EcoR I 的酶切位点为 5GAATTC。Hind的酶切位点为 5AAGCTT； DNA 经 Hind酶切后的 6 个条带从大到小依次为23130、9419、6557、4371、2322、2038。5、1949 Chargaff 从不同来源脱氧核糖
11、核酸测定出 4 种核酸碱基，即胞嘧啶 C、腺嘌呤 A和鸟嘌呤 G 和胸腺嘧啶 T。6、1953 年 Watson 和 Crick 提出 DNA 的双螺旋结构模型。他们指出，DNA 是由两条反平行的多核苷酸链组成的，分子的主链位于螺旋的外缘，碱基则堆积于螺旋的内部，两条多核苷酸链通过碱基间的氢键相结合。7、DNA，在体内通常都与蛋白质相结合，蛋白质对 DNA 制品的污染常常影响到以后的DNA 操作过程，因此，需要把蛋白质除去,一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳抽提的方法。8、PCR 的过程主要包括三个阶段，即 变性、退火、延伸。9、核酸分子的骨架是由核苷酸通过 35 磷酸二酯键连接成多核苷酸连，核苷酸是
12、其单体。10、核苷酸有三部分组成：磷酸、戊糖、碱基。影响 DNA 稳定性的因素：温度、ph、 。11、DNA 不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的空间结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是：DN A 分子由两条相互反平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成。DN A 分子中的脱氧核糖核磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。双螺旋中，碱基的配对关系是严格的，即腺嘌呤和胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤和胞嘧啶配对，如一条链上某一碱基是 C，另一条链上与它配对的碱基必定是 G。碱基之间的这种一一对应的关系叫DN A 碱基互补配对原则
13、，又称为 Watson-Crick 配对。12、原核生物 DNA 的碱基组成是均匀的；真核生物 DNA 碱基组成上的异质性主要由于存在 4 类 DNA 序列：高度重复序列、中度重复序列、单一序列、反向重复序列，这 4 类序列各具特点和意义13、组蛋白可以分为 5 种基本类型：H1 ，H2A，H2B ，H3 和 H4。14、经限制性内切酶作用产生的酶切片段可以用琼脂糖凝胶电泳分离，电泳后，DNA 片段的位置可藉溴乙锭处理而显现为可见的条带。15、在 DNA 复制过程中，相关酶的出现的先后顺序为：DNA 旋转酶、使 DNA 双股链在复制叉分离的蛋白质在复制前防止 DNA 链退火的蛋白质合成 RNA
14、 引物的酶DNA 聚合酶除去 RNA 引物的酶使冈崎片段共价连接的酶。16、DNA 的修复是指针对已发生了缺陷而实施的补救机制，DNA 的修复机制有数种方式，有直接修复、切除修复、重组修复、SOS 修复等，其中切除修复最重要。17、下列英文及代号的中文含意:(1) E.coli 大肠杆菌 (2)cDNA 互补 DNA (3)PCR 聚合酶链式反应 (4)EB 溴乙锭(5) polymerase 聚合酶 (6)SSB 单链结合蛋白 (7)IS 插入序列 (8)gene sequence 基因序列(9)tempalte 模板 (10)prime 引物 (11)clone 克隆 (12)antise
15、nse RNA 反义 RNA (13)SB 锑(14)base pair 碱基对(15)genome 基因组(16)ethal mutation 致死突变 (17)reading frame 读码框三、阐述题1、简述分子生物研究的主要内容。答：主要研究内容包括：1、DNA 重组技术：研究目标是按照研究者的设计定向的将不同的 DNA 片段进行连接，在特定的受体细胞中与载体同时复制并进行表达，从而产生遗传性状。2、基因表达调控研究：该研究主要表现在信号转导、转录基因、RNA 剪接等方面。细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子机制；转录基因是一群能与基因 5端上游特定序列专一结合，
16、从而得证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子；RNA 剪接是指真核基因当其转录成未经加工的前提 RNA 后，除在5加帽，在 3加多聚 A 之外，还有切去隔开各个相邻编码区的内含子，使外显子相邻后成为成熟的 mRNA。3、生物大分子的结构功能研究：无论是核酸、蛋白质还是多糖，首先在发挥生物学功能时必须具备特定的空间结构，其次在发挥生物学功能的过程中必定存在结构和构象的变化。结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。4、基因组、功能基因组与生物信息学研究：主要研究基因表达系统分析、蛋白质组、生物信息学等来研究基因组表达概况，基因多组样
17、性，模式生物体等。2、试述 DNA 序列分析的 Maxam 法及 Sanger 法的原理及要点。答：Maxam 和 Gilbert 法的基本原理 是使待测 DNA 的单股链，通过选定条件下专一性试剂的作用，裂解成较小的片段，由于专一性试剂只作用于特定碱基，因此，裂解产生的是具一定长度的片段。要点是：1）取待测 DNA 的一股链，使其一端（一般为 5端）用 32P标记。2）样品分为 4 份，分别在选定条件下与专一性试剂作用，每一份样品各生成一套长短不等的放射性片段。3）应用凝胶电泳分离每一反应的产生，放射自显影后，根据按长短排列、具特定末端碱基的 DNA 片段就可读出待测 DNA 的碱基序列。现
18、在应用凝胶电泳可以分离仅相差一个核苷酸的 DNA 片段，在同一凝胶板上可解析出 300 以上的条带。这一方法最初被用于测定细菌 DNA 中 lac 操纵子调节区的序列。3、试述 A-DNA，B-DNA,Z-DNA 的结构特性。种类 A-DNA B-DNA Z-DNA螺旋方向 右手性 右手性 左手性每圈螺旋的碱基数 11 10 12每一碱基对上的上升距离0.255nm 0.34nm 0.37nm螺距 2.8nm 3.4nm 4.5nm碱基对的倾斜度 20 6 7每一碱基对在螺旋中旋转的角度33 36 -60（每一个聚体）糖苷碱的构象脱氧胞嘧啶核苷 反 反 反脱氧鸟嘌呤核苷 反 反 顺糖的折叠脱氧
19、胞嘧啶核苷 C -3-内式 C -2-内式 C -2-内式脱氧鸟嘌呤核苷 C -3-内式 C -2-内式 C -2-内式总尺长 短而宽 较长而细 长而细沟的尺度大沟 细而深 宽和中等深 平伏于螺旋表面小沟 宽而浅 窄和中等浅 很窄和很深4、比较原核细胞与真核细胞的特点（包括基因的特点） 。答：1）原核细胞的细胞质较简单，其中不存在膜包围的细胞器。真核生物细胞质中有线粒体、内质网、高尔基体、液泡、叶绿体（植物中）等细胞器。2）原核细胞细胞质中分布有大量核糖体，且核糖体体积较小，其沉降系数为 70S，大亚基为 50S，小亚基为 30S。真核细胞中核糖体则排列在内质网上，其沉降系数为 80S，核糖体
20、的大亚基为 60S，小亚基为 40S。3）真核细胞中有细胞质流动及胞饮作用，原核细胞中则不存在。4）原核细胞中呼吸作用的电子传递链及光合细菌的光系统都存在于质膜上。真核细胞中呼吸作用的电子传递链存在于线粒体膜上，光合作用的光系统存在于叶绿体的类囊体膜上。5）原核细胞的细胞壁是由肽葡聚糖构成的。真核细胞的细胞壁则由纤维素和半纤维素等组成，在动物细胞中不存在细胞壁。6）原核细胞运动的细胞器是简单的纤丝。真核细胞的鞭毛或纤毛是具有“9+2”结构的微管所组成。7）原核细胞的代谢途径具有多样性，特别是在无氧产能反应方面，有多条代谢途径。真核细胞中则以糖酵解、三羧酸循环及呼吸链为主要的产能途径。原核生物
21、DNA 的碱基组成是均匀的，真核生物 DNA 碱基组成与此相反，显示出很大的不均匀性。真核生物 DNA 碱基组成上的异质性主要由于存在 4 类 DNA 序列：高度重复序列、中度重复序列、单一序列、反向重复序列，这 4 类序列各具特点和意义。真核和原核生物的差别不仅表现在重复序列上，真核生物 DNA 的单一序列也具不少特点：1）大多数的蛋白质基因是割裂基因，它们含有一些称为内含子的、转录后被切除的序列，内含子常使基因扩大 20 倍。不同内含子的长度和序列是有差异的，它们可以存在于基因的各个部位。2）真核生物 DNA 的基因间存在着转录或不转录的间隔区，即使是转录的间隔区亦不翻译成蛋白质。3）高等
22、真核生物 DNA 所含的特定基因，在一定条件下会发生扩增，扩增可能与多基因家族的形成有关。4）假基因是真核生物 DNA 的另一个特点。这些序列与真基因具高度的同源性，但由于突变而不能表达。有人估计，4 个 DNA 序列中有一个是假基因。假基因的存在扩充了真核基因组的大小。5、写出 20 种氨基酸的名称、符号及碱基代码。中文名称 符号与缩写 R 的结构 R 的性质丙氨酸 A 或 Ala CH3- 非极性精氨酸 R 或 Arg HN=C(NH2)-NH-(CH2)3- 碱性天冬酰胺 N 或 Asn H2N-CO-CH2- 极性天冬氨酸 D 或 Asp HOOC-CH2- 酸性半胱氨酸 C 或 Cy
23、s HS-CH2- 弱酸性形成二硫键谷氨酰胺 Q 或 Gln H2N-CO-(CH2)2- 极性谷氨酸 E 或 Glu HOOC-(CH2)2- 酸性甘氨酸 G 或 Gly H- 位阻最小组氨酸 H 或 His N=CH-NH-CH=C-CH2-|_|极性异亮氨酸 I 或 Ile CH3-CH2-CH(CH3)- 非极性亮氨酸 L 或 Leu (CH3)2-CH-CH2- 非极性赖氨酸 K 或 Lys H2N-(CH2)4- 碱性甲硫氨酸 M 或 Met CH3-S-(CH2)2- 甲基供体苯丙氨酸 F 或 Phe Phenyl-CH2- 非极性脯氨酸 P 或 Pro -N-(CH2)3-CH
24、-|_|非极性丝氨酸 S 或 Ser HO-CH2- 极性苏氨酸 T 或 Thr CH3-CH(OH)- 极性色氨酸 W 或 Trp Phenyl-NH-CH=C-CH2-|_|非极性酪氨酸 Y 或 Tyr 4-OH-Phenyl-CH2- 弱酸性缬氨酸 V 或 Val CH3-CH(CH2)- 非极性6、依次下列一段基因所表达的蛋白质氨基酸信息。7、试述 Sanger 法的原理及要点。答：Sanger 法的原理是在特定 2，3- 二脱氧核苷酸的存在下用合成方法生成长短不一、具特定末端的 DNA 片段。由于二脱氧核苷酸不再能延伸生成 3，5-磷酸二酯键，合成反应也就在该处停止，故这一方法也称为
25、双脱氧法。要点是：1）选取待测 DNA 的一股链为模板，使 5端标记的短链引物互补与模板的 3端。2）以样品分成 4 份，分别以 4 种脱氧核苷酸和相应于其中一种的二脱氧核苷酸为底物，加入 DNA 聚合酶 1 引发 DNA 合成。二脱氧核苷酸与正常核苷酸发生竞争，故合成反应在二脱氧核苷酸掺入处停止，结果生成一套长短不等的片段。3）应用凝胶电泳分离每一合成反应的产物。根据所得条带的位置，读出待测 DNA 的碱基序列。8、请设计一实验证明 DNA 复制的半保留性。9、什么是 PCR 技术，设计 PCR 反应的引物时应该注意几点。答：PCR（聚合酶链式反应）又称 DNA 体外扩增技术，扩增原理与 D
26、NA 复制原理相似。PCR 技术是在试管中以 DNA 为模板，利用两种脱氧寡核苷酸引物分别于特异的 DNA 片段的正链和负链的末端互补，经过模板 DNA 变性后，模板 DNA 和引物复性，在 DNA 聚合酶的催化下，发生引物链的延伸反应，引物的延伸产物与原来的模板 DNA 经过加热变性后，作为新的模板链并与另一引物互补，在聚合酶催化下有发生引物链的延伸反应，如此反复循环可使特异 DNA 区段成几何级数倍增，在几小时内合成几百万拷贝以上的目的DNA。选择引物的原则：1）尽可能的选择随机碱基分布和 GC 含量接近需要合成的 DNA 片段的引物；2）尽量避免选择带有多聚嘌呤或多聚嘧啶的片段如 Pol
27、yA、PolyT 等以及其他异常序列的引物；3）避免选择带有显著重复序列结构的片段的引物，尤其在引物的 3端；4）合成的两条引物之间不应该带有互补序列，不能形成发荚结构；5）引物不必与目标链完全配对，但在 3最后几个碱基必须完全配对，最好不要以 A 结尾合成 DNA 的两端带A 的碱基。设计一个对瘟进行 RTPCR 诊断的实验？(1).：将经临床诊断和用猪瘟胶体快速检测试剂卡诊断抗原为阳性的病猪进行解剖，取其扁桃体 淋巴结，脾脏 肝脏 肾脏 心 等组织混合处理病料 1.o2.0 克于灭菌研钵内，充分研磨后，零下 20 摄氏度反复冻容三次，每次用玻璃均匀浆器将冰冻病料进一步磨成均匀浆液，置零下
28、20 摄氏度以待下一步用（2）：用 Trirol 试剂提取 CSFV 总 RNA，方法和步骤依照试剂盒说明书所示进行操作。（3）将所提取得得 RNA 立即进行 RT-PCR 实验，反应体系如下所示： RT 反应体系：RNA 5.0L5buffer(S) 2.0L0.1M DTT 0.5L10M dNTP 0.5LRnase inhibitor 0.25LSuperscript(SS) 0.5L10M primer R 1.25LTotal 10L反应条件为 PCR 仪中：42 1h。 PCR 反应体系：10xPCR buffer 5.0L10M dNTP 1.0L10um 上游引物 2.5L10um 下游引物 2.5LTaqE 1.LcDNA 2.0L（4）扩增产物的鉴定：根据 oligo 软件结合 CSFV 石门毒株和 C 株在 GenBank 发表的基因序列，取 5L 琼脂糖电泳，设计一对上下，确定扩增产物碱基大小后，送入 TakaRa公司测序，并与 GenBank 的石门株或 C 序进行比较，相同在 85以上的确诊为猪瘟。
