1、不同微生物对不同矿物作用下 EPS 生成差异研究一、研究目的：探讨在不同矿物与不同微生物相互作用下，微生物EPS 生成种类与产生量的差异。二、实验材料：1、微生物：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胶质芽胞杆菌、酵母菌、黑曲霉2、培养基：培养基 1：牛肉膏 0.5g；蛋白胨 1g；氯化钠 0.5g；琼脂 2g；蒸馏水 100mL ；pH 7.07.2 ；灭菌 1.05kg/cm2，30 min。 （大肠杆菌、金黄色葡萄球菌适用）培养基 2：葡萄糖 10g；KH2PO4 0.2g；MgSO47H2O 0.2g；NaCl 0.2g； CaSO42H2O 5g；CaCO3 0.1g；蒸馏水1000ml，pH
2、7.07.2， 105灭菌 30min。 （胶质芽胞杆菌适用）培养基 3：葡萄糖 20g；蛋白胨 5g；酵母膏 5g；pH7.0 7.2 ，105 灭菌 30min。 （酵母菌适用）培养基 4：马铃薯 200g；蔗糖（或葡萄糖） 20g；水 1000ml，pH 自然。马铃薯去皮，切成块煮沸 30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至 1000ml。105 灭菌 30min。矿物：方解石、蒙脱石、长石（钠、钾） 、石英；PM2.5 大气颗粒物矿物前处理：超细粉碎到 2.5um 以下颗粒（分级处理？） 。三、实验方案：1、液相培养体系250mL 三角瓶中 100mL 液体培养基加入小
3、于 2.5um 的矿物颗粒物，在 30培养箱中静止培养。按加入颗粒物的量探讨在不同矿物浓度条件下诱导和刺激 EPS 生成情况。不接矿物为对照2、固相培养体系加入 15mL 相对应的固体培养基在培养皿中，矿物颗粒物加到固体培养基中（以灭菌后的矿物颗粒物均匀的涂布在培养基表层） ，然后接种细菌，30培养箱中培养，按不同的作用时间提取菌苔与矿物进行分析。不接矿物为对照四、样品分析对作用后产物固体或液体进行分析。1、EPS 提取：首先经过 3000rpm 离心 15min, 然后再用 100mmol/L NaCI 溶液洗涤两次，之后将菌苔重新悬浮至一定体积，并转移至提取容器中，放入玻璃珠若干，在超声仪
4、中超声 2min，随之置于摇床上 150rpm水平振荡 10min，再重新超声 2min，随后溶液经过 12000rpm 离心15min，得到的上清液经过 0.45um 醋酸纤维素膜过滤，就为提取EPS 溶液，然后进行化学成分分析。2、扫描电镜生物样品的制备方法:1）取矿物与细菌经相应培养基培养至对数期后用微孔滤膜(0.25um)过滤或经离心机离心获取。2）表面清洁：用蒸馏水、生理盐水、缓冲液漂洗或冲洗，清除样品表面杂物。3）固定：一般采用戊二醛、锇酸、高锰酸钾等固定液固定。通常进行双重固定，即 2%戊二醛(pH6.5) 固定 2h-4h 后，清洗 10 次，用 1%锇酸再固定 2h，再用缓冲
5、液洗 10 次。4）不同浓度的丙酮依次脱水，过程如下:40%， 5min，50% ，5min ，60%，5min ，70% ， 5 min， 80%， 5min，90%，10min ，100%，10min，100%，5min，100%，5 min。5）置换:先用 1:1 的丙酮和醋酸异戊酯置换，再用 100%醋酸异戊酯置换。6）临界点干燥：经临界点干燥仪进行干燥。7）离子溅射。8）扫描电镜观察并拍照记录。3、透射电镜(TEM) 生物样品的制备 (超薄切片法 )1）取材：离心获取细菌。2）固定：一般采用双重固定，即戊二醛固定 1h-3h 后，经相应缓冲液清洗，再用 1%锇酸后固定 1h-2h。3
6、）脱水：一般过程为 30%乙醇或丙酮，5min-10min，50%乙醇或丙酮，5min-10min， 70%乙醇或丙酮，5min-10min，90%乙醇或丙酮，10min-15min，100% 乙醇或丙酮(三次，每次各 10min-15min)。4）渗透：包括两步，(1) 将样品置于 100%脱水剂及等量包埋剂的混合液中(室温、5-8h 或过夜);(2)将样品置于纯包埋剂中(室温、5h-8h 或过夜) 。5）包埋：经过上述的渗透之后，即可进行包埋，常规的包埋是把经渗透后的样品挑入已装有少量包埋剂的胶囊内，或特制的锥形塑料囊，或多孔橡胶模板中，将胶囊灌满包埋剂，放入标签，然后根据包埋剂聚合时所需
7、的温度及时放入温箱聚合，制成包埋块。6）超薄切片：在超薄切片机上将材料切成 600-900 的厚度。7）染色：普遍采用双重染色，即先用醋酸铀染色，再用硝酸铅染色。8）透射电镜观察并拍照记录。4、EPS 成分分析测定 EPS 为液体和固体中的含量取培养良好的菌液（总挥发性固体含量 VSS 约为 6 g /L）, 加入少许 NaCl 后轻轻搅拌清洗三次 , 随后 60 水浴加热 1 h，18000 rpm 离心 20 min 剥离 EPS， 经 0.22um 滤膜过滤后，将滤液置于截留分子量 3500 Da 的透析袋中，密闭后置于盛有蒸馏水的烧杯中 4 透析 12 h，得到实验所用 EPS，于-
8、18 冰箱保存备用。EPS 的蛋白质测定采用考马斯亮蓝比色法，多糖用蒽酮比色法。40mL 细菌培养液首先在 4下 12000 rpm 离心 10min，0.9%NaCI 溶液水洗两次。然后将收集到的菌体重悬于0.9%NaCI 溶液中，在 4下，加入浓度为 2%的 EDTA 提取剂 10mL，提取时间为 3h。提取结束后，溶液在 12000rpm 离心 15min 去除残留的细胞。提取和离心的温度保持 4是为了避免细胞溶解和破坏EPS 的结构。由于 EDTA 会干扰蛋白的测定，还需将用 EDTA 提取的EPS 溶液透析 24h。最后将得到的 EPS 溶液通过 0.45um 醋酸纤维素膜过滤待用。
9、多糖浓度采用蒽酮法测定，以葡萄糖为标准物质。蛋白浓度用 Lowry 法来测定，以卵清蛋白为标准物。核酸的浓度采用紫外吸收法测定。接触角测定：接触角测定所使用的测试液体为水、1-溴萘和甲酰胺。首先将一定量的微生物菌体抽滤到 0.45um 醋酸纤维素膜上，用双蒸水洗涤两次，然后放在 1%琼脂板上保持菌体水分。测定污泥的接触角前，将膜剪一小条下来放在载玻片上，干燥 10min。然后采用静滴技术，将 1uL 水、1- 溴萘和甲酰胺滴到膜片上，采用 CCD将液滴的形状拍摄下来，最后用软件分析计算污泥的接触角。对每一个样品，每一种液体都至少测定 10-15 次，取平均值。Zeta 电势测定：Zeta 电势
10、使用 Zeta 电势测量仪测定，菌体温度保持 25。测定前，菌体首先被重新分散在不同电解质强度的 NaCI溶液中，稀释后的细菌浓度大约为干重的 0.002%0.005% ，溶液 pH仍旧保持在约 7.0。通过 Smoluchowski 方程计算得到的体系电泳迁移率，可得到菌液所对应的 zeta 电势。实验中对每一个样品都分别测量 6 次，结果取平均值。细胞干重(DCW) 测定：细菌培养液首先在 4下 6500rpm 离心10min，0.9%NaCI 溶液水洗两次。最后将细胞冷冻干燥 24h。冷冻干燥后的细胞重量除以相应发酵液体积即为细胞干重。PHAs 含量测定：将冷冻干燥所得细胞用氯仿(10m
11、L 氯仿/0.2g 干细胞) 破壁， 60保温 24h，过滤，滤液自然晾干，即为 PHAs。提取出的 PHAs 重量与相应细胞干重的比值即为 PHAS 在细胞中的含量，DCW 减去相应 PHAS 重量即为残留细胞重量。PHAs 组分的测定：气相色谱法，氢火焰检测器。毛细管柱（30mx0.320mmx0.25um，HP-5，美国） ，以含 22%（摩尔百分比）HV（hydroxyvalerate）组分的 PHAs 为标准品（403113， Milwaukee，美国） 。将 50mgPHAs 置于 5mL V 型Wheaton 样品瓶中，加入 2mL 氯仿，2mL 含 15%硫酸以及 2g/L 苯甲酸的甲醇溶液，80水浴 4h，取出后在试管中加入 1mL 去离子水并剧烈振荡，待溶液分层后取下层（有机相）检测。色谱条件：氮气为载气，氢气为燃气，空气为助燃气。进样室 220，检测室 250；初温 80，保持 4min，后以 10/min 升至 200，保持 1min。5、固相成分分析矿物物相及成分分析，用 XRD 分析作用前后物相变化与新物质的生成。XPS 分析，AFM 分析。6、液体中离子含量测定用 ICP-AES 分析测定溶液中主要金属离子含量，离子色谱分析主要阴离子的含量。
