1、项目类别 申报学科代码 1 科学部编号A C010904国家自然科学基金申 请 书项目名称：申 请 者：所在单位：邮政编码：通讯地址：电 话：传 真：申请日期：国家自然科学基金委员会一九九七年制-1-一、简表中文 刺 梨 白 粉 病 抗 性 候 选 基 因 的 克 隆名称 英文 Cloning of Powdery Mildew Resistance Gene Candidates of Cili (Rosa roxburghii)A. 自由申请 B. 高技术探索 C. 青年 D. 地区类别E. 重大 F. 重点 H. 专项 D高技术探索项目主题号名称 1 名称 2申报学科 代码 1 代码 2
2、A. 基础研究B. 应用基础 A申请金额 起止年月 2003 年 1 月至 2005 年 12 月研究项目所用实验室 A.国家重点 B.部门开放 A 实验室编号 13269202中文 A.男 出生年月 名称 汉姓名 拼音性别 B.女 A 身份证号 民族民族 代号 01名称 副教授 国( 地区) 中国专业技术职务 代码学位A.博士B.硕士C.学士 B博士学位授予国别或地区 代码 156A.院士B.博士生导师C.博士后名称 系(所) 单位代码邮政编码 名称性质A.高等院校B.科研机构C.其它 A 申请者电话隶属关系 代码申 请者 所在单位 所在地总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 参
3、加单位数姓名 身份证号 专业技术 职务 所在单位名称及代码 项目中的分工 签字项目组主要成员（不含申请者）-2-多 数 植 物 抗 病 基 因 编 码的的 蛋 白 质 具 有 NBS-LRR 保守 结 构 域 。 本 项 目 拟 以 我 国 特 有 果 树 刺 梨 为试 材 ， 基 于 NBS-LRR 结 构 域 设 计 简 并 引 物 ， 扩 增对 白 粉 病 抗 、 感 类 型 基 因 组 DNA ， 然 后 回 收 、克 隆 后 选 基 因 片 段 ； 应 用 双 假 测 交 原 理 ， 采 用BSA 法 ， 确 定 克 隆 的 片 段 和 抗 病 性 的 关 系 ； 通过 构 建 BA
4、C 文 库 ， 以 获 得 后 选 抗 病 基 因 的 全 长摘 要序 列 。主题词 1. 主题词数量不多于三个；2. 主题词之间空一格（英文用/ 分隔） 。中文 刺 梨 抗 病 后 选 基 因 克 隆研究内容和意义英文 Rosa roxburghii/ Resistance gene candidate/ Cloning简表填写要求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写， 申请其重点项目时项目类别也填写 B，并在申请书
5、封面右上角加注“高技术探索课题重点项目” 。二、凡选择性栏目，将相应提示符 A、B 等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容和范围，最多不超过 25 个汉字（包括标点符号） 。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填写主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月起始时间从申请的次年 1 月算起。终止时间为完成年度的 12 月。所用实验室系指研究项目将利用的实验室，仅
6、填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所” 不得填 “中科院西安光机所”或“西安光机所” 。全称中的数字，一律写中文，例如： 中国航天工业总公司第七一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编 入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（合作者所在单位） ，以 阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作 用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义摘要与主题词均
7、录入软盘。-3-二、立论依据（包括项目的和研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对 基 础 研 究 ， 着 重 结 合 国 际 科 学 发 展 趋 势 ， 论 述 项 目 的 科 学 意 义 ;对应用基础研究， 着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题， 论述其应用前景。刺梨（Rosa roxburghii,Tratt）属蔷薇科蔷薇属植物，集中分布于西南地区，在桂西北、湘西、鄂西及陕南等地也有分布。其果实肉脆、甜酸、具浓郁的特殊香味，Vc 含量高达20543541mg/100g，被誉为水果中的“Vc 之王” （朱维藩等，1984） 。除鲜食外，更是加工高级饮品的
8、优质原料，尤其是刺梨的防癌、抑癌作用和抗衰老、降血脂、增强免疫力、解铅中毒等保健作用已引起国内外的广泛关注（樊卫国等，1997；Ma et al,1997） ，与猕猴桃、山楂并誉为我国三大新兴水果（史继孔等，1991） 。近年来，贵州省政府将其列为今后培育的八大产业经济之一，在西部开发的大潮中，亦将其作为特色产业来开发。自上世纪 80 年代以来，经几代果树科研人员的辛勤耕耘,贵州选育出一些优良株系（朱维藩等，1984；向显衡等，1987） ，有的已直接用于大面积生产，产生了较大的经济效益。先后有 20 多个省市从贵州引种，在部分地区建立了生产基地。1815 年，刺梨由传教士 Roxburgh
9、经印度引入欧洲，因其果实表面有刺，形同板栗的总苞而被称为栗玫瑰（Chestnut rose） ，在欧洲及美国等地将其作为观赏植物来培植(Fangan, 1988)。近年来的研究表明，刺梨对玫瑰的黑斑病（Blackspot）具有免疫能力，在玫瑰抗病育种中倍受青睐(Wiggers et al, 1997)。但是在刺梨的人工栽培中，白粉病（S phaerotheca ）为害严重，主要表现为 46 月为害刺梨的嫩叶和花果，造成叶片和花果脱落（庞纯翠等，1986） 。经过 20 多年的选育工作，获得了一个对白粉病高抗的株系（待发表） ，这一珍贵的种质资源为培育刺梨的白粉病抗性品种及直接分离抗性基因提供了
10、物质基础。不幸的是，迄今为止对刺梨的遗传基础研究极为薄弱。过去人们对植物抗病基因的结构和功能缺乏认识，只能依赖图位克隆（Map-based cloning/Positional cloning）或转座子标签技术(Transposon tagging)对植物抗病基因进行克隆，并在一些一年生植物上得到成功应用(董继新等，2001) 。但多拷贝基因的存在以及插入位点的随机性极大地限制了转座子标签法的应用范围（Dixon et al,1996） ，同时木本植物很难获得转座子突变体。图位克隆法是近些年来发展起来的另一种有效方法，但高密度的分子标记遗传图谱是该方法不可逾越的一道鸿沟，目前的应用仅限于基因组
11、较小的一些模式植物。-4-近 年 来 ， 随 着 分 子 生 物 学 和 基 因 克 隆 技 术 的 发 展 ， 对 一 些 抗 性 基 因 的 分 子 特 性 有 了 新的 认 识 （ Baker et al, 1997;Hammond-Kosack et al ,1997;董继新等，2001） ， 从 而 在 一 定 程 度上 促 进 了 基 因 的 分 离 和 克 隆 研 究 。 利 用 同 源 序 列 克 隆 技 术 （ Homology-based cloning） 已 成功 地 分 离 出 小 麦 叶 锈 病 抗 性 基 因 Lr10（ Fenillet ， 1997） 及 拟 南
12、 芥 白 粉 病 的 广 谱 抗 性 基 因RPW8（ Xiao et al, 2001） 。 剖 析 已 克 隆 的 20 余 例 植 物 抗 病 基 因 ， 发 现 大多数抗病基因编 码的 蛋 白 质 都含有 核 苷 酸 结 合 位 点 （ Nucleotide bindign site, NBS)和亮氨酸富集重复序列（ Leucine-rich repeat， LRR）结构域（董继新等，2001；郑先武等，2001；Deng et al,2000） ，如拟南芥 Rps2、 Rpm1、 Rpp5 基因，番茄 Prf 和 I2 基因，亚麻的 L6 和 M6 基因，烟草的N 基因等（ Mind
13、rinos et al, 1994; Whitham et al, 1994;Hammond-Kosack et al ,1997） 。诸 多 研究 显 示 ， 以 这 些 保守氨基酸序列设计简并引物对进行 PCR 扩增，获得的部分抗病候选基因（Resistance gene candidate，RGC）或抗病基因类似物(Resistance gene analog，RGA) 和已知的病毒、细菌、真菌或线虫抗性基因位点紧密连锁，有的甚至就来自于抗性基因（郑 先 武 等 ，2001； Kanazin et al,1996; Shen et al ,1998; Speulman et al ,19
14、98; Deng et al, 2000） 。这不仅预示了植物抗病基因抗病的可能机理，也为抗病基因的克隆提供了新途径（H ammond-Kosack et al ,1997)，特别是对于生命周期长， 遗 传 上 高 度 杂 合 ， 遗 传 背 景 知 之 甚 少 的 果 树 ， 基 于 这些 保 守 结 构 域 的 同 源 序 列 克 隆 法 已 引 起 学 术 界 的 极 大 兴 趣 （ Deng et al, 2000） 。采用同源序列法克隆抗病候选基因，有很多成功的报道。Leister 等（1996）根据拟南芥的抗病基因 RPS2 和烟草的抗病基因 N 的高度保守的 LRR 序列设计引物
15、，对马铃薯基因组DNA 进行 PCR 扩增，获得了与已知抗病基因同源、与抗线虫病基因 Grol 和抗晚疫病基因R7 完全连锁的 DNA 片段。Y u 等 （ 1996） 根 据 烟 草 N 和 拟 南 芥 RPS2 基 因 编 码 蛋 白 质 的NBS 同 源 序 列 设 计 简 并 引 物 ， 从 大 豆 中 克 隆 出 11 类 含 NBS 序 列 的 片 段 ， 其 中 5 个 定 位 于已 知 的 抗 病 基 因 附 近 ； 贺 英 超 等 （ 2001） 以 抗 花 叶 病 毒 的 大 豆 品 种 为 试 材 ， 基 于 大 多 数 抗病 基 因 的 NBS-LRR 保 守 区 域
16、的 特 点 ， 设 计 特 异 简 并 引 物 对 ， 克 隆 出 与 大 豆 抗 花 叶 病 毒 基 因Rsa 位 于 同 一 连 锁 群 的 KNSB2 序 列 ， 经 Northern 检 测 ， KNSB2 在 大 豆 的 根 、 茎 和 叶 中 为 低丰 度 的 组 成 型 表 达 。 同 样 ， 以 NBS-LRR 结 构 设 计 的 简 并 引 物 对 ， 从 水 稻 中 克 隆 出 了 大 小约 520bp 的 片 段 ， 通 过 序 列 比 较 分 析 发 现 ， 其 编 码 产 物 属 于 抗 病 基 因 同 源 序 列 ， 并 发 现 其中 一 个 来 自 抗 白 叶 枯
17、 病 基 因 家 族 （ 郑 先 武 等 ， 2001） 。 在 水 稻 及 禾 本 科 的 其 他 作 物 上 ， 也 开展 了 卓 有 成 效 的 工 作 (薛 永 彪 等 ， 1998； Spielmeyer et al, 1998)。 迄 今 为 止 ， 基 于 抗 病 基 因 的NBS-LRR 结 构 域 而 采 用 同 源 序 列 法 克 隆 RGC 的 一 年 生 作 物 还 有 大 麦 （ Seah et al,1998） 、小 麦 (薛 永 彪 等 ， 1998； Seah et al,1998)、 菜 豆 (Creusot et al, 1999)、 莴 苣 （ Shen
18、et al, -5-1998） 和 番 茄 (Ohmori et al,1998)等 。 但 是 应 该 看 到 ， 该 方 法 在 多 年 生 作 物 上 报 道 很 少 ， 仅在 柑 桔 上 ， Deng 等 人 （ 2000） 取 得 了 较 大 进 展 ， 克 隆 出 39 个 RGC， 部 分 RGC 和 抗 柑 桔速 衰 病 （ Ctv） 及 柑 桔 线 虫 抗 性 基 因 (Tyr1)紧 密 连 锁 ， 为 发 展 柑 桔 抗 病 基 因 分 子 标 记 和 全 基因 的 克 隆 奠 定 了 坚 实 基 础 。 因 此 ， 基 于 NBS-LRR 的 同 源 序 列 法 获 得
19、的 RGC， 不 但 可 发 展为 植 物 抗 病 基 因 的 更 精 确 定 位 的 分 子 标 记 ， 而 且 有 可 能 广 泛 应 用 于 包 括 多 年 生 果 树 在 内 的其 他 作 物 抗 病 基 因 的 克 隆 策 略 中 （ (薛 永 彪 等 ， 1998； Hammond-Kosack et al ,1997;Speulman et al， 1998； Deng et al, 2000） 。抗 病 性 状 分 子 标 记 的 遗 传 分 析 ， 通 常 采 用 近 等 位 基 因 系 （ Near-isogenic lines,NILs） 为试 材 ， 但 对 包 括 木
20、 本 植 物 在 内 的 绝 大 多 数 植 物 ， 要 获 得 近 等 位 基 因 系 非 常 困 难 。 为 此 ，Michelmore 等 (1991)开 发 了 集 团 分 离 体 分 析 法 （ Bulked segregant analysis, BSA） ， 其 作 法 为以 F2 代 群 体 为 材 料 ， 按 目 标 性 状 的 表 现 （ 如 抗 病 性 强 弱 ） ， 挑 选 出 两 个 极 端 类 型 组 成 两 个基 因 池 （ Bulks or Pools） ， 每 个 池 内 的 目 标 性 状 一 致 而 不 管 其 它 性 状 的 表 现 ， 这 样 两 个
21、基 因池 分 子 标 记 的 多 态 性 既 与 用 于 构 建 基 因 池 的 目 标 性 状 连 锁 。 该 方 法 也 可 应 用 于 数 量 性 状 研究 （ Ling et al, 2000） 。 但 是 ， 对 生 长 周 期 长 、 树 体 高 大 、 很 多 种 类 自 交 不 育 的 果 树 来 说 ，要 构 建 F2 代 群 体 绝 非 易 事 ， 目 前 仅 在 桃 上 有 采 用 F2 代 进 行 BSA 的 报 道 （ Chaparro et al, 1994） 。 实 际 上 ， 绝 大 多 数 果 树 栽 培 品 种 为 杂 合 体 ， 许 多 基 因 位 点 都
22、 会 在 自 交 或 杂 交 中 分 离 ，采 用 双 亲 都 为 高 度 杂 合 的 品 种 或 株 系 杂 交 ， 其 杂 交 一 代 性 状 分 离 复 杂 ， 产 生 双 假 测 交（ Double pseudotest cross） 现 象 ， 利 用 其 F1 代 群 体 ， 应 用 BSA 法 可 以 直 接 进 行 果 树 的 基因 定 位 （ 卢 江 ， 1995） 。 该 方 法 已 在 苹 果 、 柑 桔 等 遗 传 背 景 复 杂 的 多 年 生 果 树 上 得 到 成 功 应用 （ Deng et al,2000)。在 植 物 白 粉 病 抗 性 基 因 的 克 隆
23、上 ， 前 人 取 得 了 很 大 进 展 。 Buschges 等 （ 1997） 采 用 图位 克 隆 法 分 离 出 大 麦 白 粉 病 抗 性 基 因 Mlo； Xiao 等 （ 2001） 采 用 同 源 序 列 法 分 离 出 拟 南 芥白 粉 病 广 谱 抗 性 基 因 RPW8； 而 通 过 NBS 设 计 简 并 引 物 的 策 略 ， 在 大 豆 上 克 隆 出 与 大 豆 白粉 病 抗 性 连 锁 的 2 类 共 7 个 候 选 基 因 ， 为 基 因 的 全 序 列 克 隆 奠 定 了 基 础 (Yu et al, 1996)。 这表 明 ， 基 于 NBS-LRR 的
24、同源序列法有可能分离出植物的白粉病 RGC。本 研究拟以刺梨白粉病抗性株系为试材，采用大多数植物抗病基因所具有的 NBS-LRR结构特征，设计特异简并引物对进行 PCR，分离和克隆候选基因。同源序列克隆与 BSA 结合应用，可以在不知道遗传背景和没有遗传、物理图谱的情况下开展刺梨白粉病抗性基因的克隆工作。通过刺梨的白粉病高抗和极感株系的杂交后代，采用 BSA 法，由此确定克隆出的 RGC 与刺梨白粉病抗性的遗传关系。并以与刺梨白粉病抗病紧密连锁或共分离的 RGC 转-6-化为探针，筛选文库，以期获得完整的基因。课题的实施，对刺梨白粉病抗性候选基因的获得，分子标记辅助选择抗病类型具有重大意义，并
25、为最终获得完整的抗病基因及进一步开展重要性状的遗传定位奠定坚实的物质和技术基础。主 要 参 考 文 献1. 朱维藩等，1984，贵州的刺梨资源及其生长发育、Vc 含量同生态条件关系的调查究。贵州农学院丛刊，3：113。2. 庞纯翠等，1986， 刺梨白粉病的发生、发展极其防治的研究。贵州农学院丛刊，8：3538。3. 向显衡等，1987，贵州省刺梨种质资源利用研究。中国水土保持，7：3435。4. 卢江，1995，基因定位极其在园艺作物遗传育种中的应用。园艺学年评，1：165179。科学出版社。5 史继孔等，1991，我国刺梨研究进展。贵州农学院学报,10(2)：8894。6. 樊卫国等，19
26、97，贵州省刺梨资源开发利用及对策。西南农业学报，10（3）：109115。7. 薛永彪等，1998，水稻基因组中 R 类抗病基因同源序列的分离。科学通报，43（3）：277281。8. 贺超英等，2001，大豆中 NBS 类抗病基因同源序列的分离与鉴定。科学通报，46（12）：10171021。9. 董继新等，2001，植物抗病基因研究进展。植物病理学报，31（1）：19。10.郑先武等，2001，水稻 NBS-LRR 类 R 基因同源序列。中国科学（C 辑） ，31（1）：4351。Baker B et al, 1997, Signaling in plant-microbe intera
27、ctions. Science, 276: 726733.Chaparro J K, 1994, Targeted mapping and linkage analysis of morphological isozyme, and RAPD markers in peach. Theor Appl Genet, 87: 805815.Creusot F et al, 1999, Cloning and molecular characterization of three members of the NBS-LRR subfamily located in the vicinity of
28、the Co-2 locus for anthracnose resistance in Phaseolus vulgaris. Genome, 42:254264.Deng Z et al, 2000, Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance-gene candidate sequences in citrus. Theor Appl Genet, 101: 814822.Dixon M S et al, 1996, The tomato CF-2 disease resistance locus comprises
29、two -7-functional genes encoding leucine-rich repeat proteinsJ. Cell, 84: 451459. Fagan G, 1988, Roses At The Cape Of Good Hope. Breestraat-Publikasies, Cape Town, South Africa, 1988, pp. 210-211.Fenillet C, 1997, Molecular cloning of a new receptor-like kinase gene encoded at the Lr10 disease resis
30、tance locus of wheat. The Plant J.,11: 4552.Hammond-Kosack K E, 1997, Plant disease resistance genes. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bio 48: 575607. Kanazin V, 1996, Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean. Proc Natl Acad Sci USA, 93: 1174611750.Leister D,1996, A PCR-based a
31、pproach for isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wide application in plants. Nature Genet, 13: 421429. Theor Appl Genet, 100:10101017.Ling P et al, 2000, Inheritance of citrus nematode resistance and its linkage with molecular markers. Ma Y X et al , 1997, The aging ret
32、arding effect of Long-Life CiLi. Mechanisms of Ageing and Development, 96, 171-189.Michelmore R W et al,1991, Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc
33、 Natl Acad Sci USA, 88: 98289832. Mindrinos M, 1994, The A. thaliana disease resistance gene RPS2 encodes a protein containing a nucleotide-binding site and leucine-rich repeat. Cell, 78: 10891099.Ohmori T et al, 1998,Characterization of disease resistance gene-like sequences in near-isogenic lines
34、of tomato. Theor Appl Genet, 96: 331338.Seah S et al, 1998, Cloning and characterization of three members of a family of disease resistance gene analogs from wheat and barley. Theor Appl Genet, 97: 937945.Shen K A, 1998, Resistance gene candidates identified by PCR with degenerate oligonucleotide pr
35、imers map to clusters of resistance genes in lettuce. Mol Plant-Microbe Interact, 11: 815823.Speulman E et al, 1998, Disease resistance gene homologs correlate with disease resistance loci of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 14(4): 467474.Spielmeyer W, 1998, A superfamily of disease resistan
36、ce gene analogs is located on all homoeologous chromosome groups of wheat. Genome, 41(6): 782788.Whitham S et al, 1994, The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: -8-similarity to toll and the interleukin-1 receptor. Cell, 78: 11011115.Wiggers R J et al, 1997, Conidial germination an
37、d infection by Diplocarpon rosae on susceptible and resistant rose species. Mycologia, 89(1): 103-108 .Xiao S et al, 2001, Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science, 291(5501):118120.Yu Y G ,1996, Isolation of a superfamily of candidate disease-resistance gen
38、es in soybean based on a conserved nucleotide-binding site. Proc Natl Acad Sci USA, 93: 1175111756.-9-三、研究方案-10-1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：（1）克隆 30 条左右后选基因片段，测定其 DNA 序列；（2）确定克隆出的后选基因与白粉病抗性的关系；（3）建立刺梨细菌人工染色体（BAC）文库；（4）利用后选基因片段筛选 BAC 文库，获得后选抗病基因的全长序列。研究内容（1）根据植物抗病基因编码蛋白质的保守结构域 NBS-LRR，设计简并引物对；（2）寻找、扩增、
39、克隆与抗病基因有关的 DNA 片段；（3）克隆的测序，与已知抗病基因序列进行比较分析，剖析所获片段的可能特性；（4）以扩增片段为探针，对亲本及 F1 代进行 RLFP 分析，运用“双假测交”原理，采用 BSA 方法，确定 RGC 与白粉病抗性的遗传关系；（5）刺梨 BAC 文库的构建；（6）从文库中筛选含抗病基因的克隆。拟解决的关键问题（1）刺梨特异 PCR 实验体系的建立；（2）特异简并引物对的筛选、特异扩增带的寻找、回收和克隆；（3）RGC 与已知抗病基因的比较分析；（4）RGC 与刺梨白粉病抗性遗传关系的确定；（5）刺梨 BAC 文库的构建，抗病基因克隆的筛选。2. 拟采取的研究方法、技
40、术路线、实验方案及可行性分析研究方法和实验方案（1）特异引物对的设计 根据已知抗病基因编码蛋白质的 NBS-LRR 保守结构域，设计特异简并引物对。对白粉病高抗和感病株系的 DNA 进行 PCR 扩增，找出特异带；（2）特异片段的克隆 对高抗株系 DNA 进行 PCR 扩增，回收特异带，然后对其进行连接并转化到感受态的大肠杆菌上，获得转化的克隆储藏备用；（3）克隆的测序和序列分析 将获得的克隆进行测序，然后通过 GeneBank 和其他已知的抗病基因进行对比，并通过蛋白质序列分析软件包 ANTHEPROT（Version 5.0）-11-进行蛋白质结构预测和特性分析，粗选出可能的后选基因；（4
41、）遗传相关性分析 以高抗类型、极感病类型及其 F1 代遗传群体为试材, 按抗性的大小，将 F1 代群体里的极端类型（高抗和极感类型）标出，连同双亲共 4 个类型。每个类型 10 株左右，取相同量的叶片混合后抽提 DNA，构建基 因 池。再将回收出的后选基因片段转成探针，对上述基 因 池 DNA 进行 RFLP 分析，根据 “双假测交”原理，采用 BSA 方法，确定片断和白粉病抗性的遗传关系；（5）刺梨基因组的 BAC 文库的构建 （6）文库筛选：以通过检验的与抗病相关的扩增片段制备探针，采用高密度菌落原位杂交法筛选刺梨的 BAC 文库，将阳性的 BAC 克隆进行亚克隆，并将亚克隆再与扩增产物杂
42、交，获得阳性亚克隆。（7）亚克隆序列分析 将阳性亚克隆有选择地进行测序，并与其他植物已分离抗病基因进行比较分析，研究抗病基因在不同植物中的结构差异及进化关系。将分离到的部分亚克隆连接到植物表达载体上，为鉴定候选基因的功能（抗病性）及转化感病品种奠定基础。技术路线流程：引物设计，特异 PCR抗 病 类 型感 病 类 型DNA 分 离有性杂交，获得 F1 代群体组建基 因 池，分离 DNA以回收片段为探针，进行RFLP 分析克隆片段与抗病性遗传关系的分析特异片段的回收、克隆测 序序列分析BAC 文库构建文库筛选，获得阳性克隆亚 克 隆测 序比 较 分 析植 物 表 达载 体 构 建-12-可行性分
43、析本 研究旨在以刺梨白粉病抗性株系为试材，采用植物大部分抗病基因编码蛋白质所具有的 NBS-LRR 保守结构域，设计特异简并引物对进行 PCR，分离和克隆抗病候选基因。这种方法已在拟南芥、水稻、大豆、小麦、番茄及柑桔等植物中得到成功应用。同源序列克隆与 BSA 结合应用，可以在不知道遗传背景和没有遗传、物理图谱的情况下开展刺梨白粉病抗性基因的克隆工作。同时通过刺梨的白粉病高抗和极感株系杂交产生的后代，运用“双假测交”原理，采用 BSA 法，确定克隆出的 RGC 与刺梨白粉病抗性的遗传关系。申请人已在“作物遗传改良国家重点实验室”从事了两年的分子生物学研究工作，并已获得了 F1 代杂交种子，课题
44、一旦获得立项，其分子生物学研究内容将在国家重点实验室进行，申请小组已具备课题顺利实施的物质和技术基础。3课题的创新之处图 位 克 隆 和 转 座 子 标 签 法 费 时 长 且 极 为 昂 贵 ， 在 木 本 植 物 上 尚 未 见 成 功 的 报 道 。 刺-13-梨 遗 传 基 础 研 究 十 分 薄 弱 ， 但 杂 交 座 果 率 高 、 种 子 多 ， 建 立 遗 传 群 体 相 对 容 易 。 申 请 小组 拟 采用大部分已知抗病基因所共有的 NBS-LRR 保守结构域设计特异简并引物对，通过PCR 扩增，可以在缺少遗传、物理图谱的情况下，对我国珍稀果树刺梨进行白粉病抗性候选基因的克
45、隆。同源序列克隆与 BSA 相结合，可以找出与白粉病抗性紧密连锁或共分离的后选基因，然后再通过筛选 BAC 文库可望克隆全长的基因；同时，该连锁关系的确定还将为刺梨遗传图谱的进一步构建奠定基础。4. 年度研究计划及预测进展2003 年(1) 以 NBA-LRR 设计简并引物，进行特异 PCR，特异带的回收及克隆，测序及序列分析；(2) BAC 文库的构建；(3) 基 因 池的构建及 DNA 的分离。2004 年(1) 以回收片段为探针进行 RLFP 分析；(2) 采用 BSA 法分析克隆片段与抗病性的遗传关系；(3) 文库筛选，获得阳性克隆。2005 年(1) 亚克隆，测序及序列的比较分析；(
46、2) 植物表达载体的构建；(3) 论文撰写及课题的鉴定验收。5. 预期研究成果（1）克隆出刺梨白粉病抗性后选基因；（2）确定与刺梨白粉病抗性连锁或共分离的分子标记；（3）建立刺梨 BAC 文库；（4）表达质粒载体的构建；（5）在国内外刊物上发表较高水平的论文 35 篇。-14-四、研究基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩从 2001 年 2 月起，在国家自然科学基金其他项目和贵州省自然科学基金的资助下，申请小组借助“作物遗传改良国家重点实验室” （依托单位：华中农业大学）的实验条件，已开展了一年多的前期工作，取得了以下进展：（1）建立起刺梨及其近缘种的 DNA 分离技术及
47、 RAPD 实验体系；（2）完成了刺梨及其近缘种的 RAPD 分析，刺梨主要栽培类型 RAPD 指纹图谱的构建，并撰写论文一篇，已投 Euphytica；（3）通过高抗类型和重感类型的有性杂交，获得了 F1 代种子；（4）建立起刺梨特异 PCR 实验体系；完成了简并引物对设计，引物对筛选及特异带的寻找工作；（5）初步完成了特异带的回收，获得了部分克隆；（6）申请小组已具备该项目顺利实施的技术储备。2. 已具备的实验条件， 尚缺少的实验条件和拟解决的途径 (包括利用国家重点实验室和部开放实验室的计划与落实情况) 申请人从 1999 年起，在“作物遗传改良国家重点实验室”攻读在职博士学位。申请项目
48、一旦立项，全部分子生物学工作将在“作物遗传改良国家重点实验室”开展，实验室拥有较好的分子生物学实验条件和技术平台，无须添置大型仪器设备就能保证项目的顺利实施。3. 申请者和项目组成员的学历和研究工作简历， 近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及其在本项目中承担的任务; 青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位*论文：作者题目刊名年份卷（期）页码-15-专著：作者书名出版者年份-16-五、经费预算支出科目金额(万元)计算依据及理由1科研业务费 3.0资料复印、论文印刷(1.0)， 学术会议(0.8)， 旅差费(0.7)， 零工(0.5)2实验材料费 11.11
49、）分子生物学试剂 8.6引物合成及PCR（0.8） ，回收及克隆（1.5）, 测序（1.5）,酶（2.0） ， 同位素(1.5)， 尼龙膜(0.5) ，其他分子生物学试剂（0.8） 2）电泳试剂 1.0 琼脂糖(进口)，Tris等3)其他易耗品 1.5胶卷， 培养皿， 试管，三角瓶， 试剂瓶， Eppendorf 管， tips， 酒精，液N2，DNA抽提试剂，如苯酚、氯仿、PVP等3仪器设备费 0.51）移液枪 0.5 Gilson 20， 100， 200l各1支4实验室改装费 05协作费 4.0国家重点实验室台面费（2.0）,协作单位管理费(2.0) 6项目组织实施费 0.9-17-合计 19.5注： 预算支出科目按下列顺序填写： 1. 科研业务费 2. 实验材料费 3. 仪器设备费 4. 实验室改装费 5. 协作费 6. 项目组织实施费。 开支范围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。-18-六、申请者正在承担的其他研究项目(攀登计划、863 计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等
