1、3-8 高效液相色谱法应用举例,3.8.1 正相键合相色谱法 3.8.2 反相键合相色谱法 3.8.3 反相离子对色谱 3.8.4 离子色谱法 3.8.5 空间排阻色谱法,3-8 高效液相色谱法应用举例,3.8.1 正相键合相色谱法 3.8.1.1 正相键合相色谱法测定柴油烃族组成 1 仪器 HP1050高效液相色谱仪; TFJ-Y100烃族分析仪; 9300型色谱工作站; 7125进样阀、7000六通切换阀; 氨基键合柱,Pherisorb NH2,5m,4.6mm200mm; 氰基柱,4.6mm20mm。,2 试剂 正己烷 分析纯,活化后经硅胶脱芳烃、过滤、除气后使用; 二氯甲烷 经蒸馏、
2、分子筛脱水、过滤、除气后使用。 3.氢火焰检测器(FID) 主要操作参数 催化炉温度350;氧化炉温度750;清洁炉温度800;喷雾压力0.04 MPa; H2流速45ml/min; N2流速17ml/min。,（1）采用液相色谱分离、移动丝氢火焰检测器分析柴油馏分(180-370)的饱和烃和烯烃总量、单环芳烃、双环芳烃、多环芳烃和胶质类组分的含量是可行的。该法具有简单、快速、准确、分析时间短等优点。 （2）通过方法的准确性和可靠性检验,饱和烃和芳烃在较宽的范围内均有良好的线性。 （3）移动丝氢火焰检测器与解决了不同油品响应因子不同的问题,提高了测定结果的准确性,是目前测定重馏分油最合适的检测
3、器,但相对而言该检测器的操作较繁琐。 总之,该方法的建立对柴油加工工艺的优化及柴油产品的质量评价有着积极的作用,它也可作为柴油烃族组成基础数据的测定手段,为快速近红外光谱分析打下基础。,3.8.2 反相键合相色谱法,3.8.2.1 反相键合相色谱法测定水中荧蒽 1.仪器和试剂 (1)Agilent 1100高效液相色谱系统;四元泵;梯度阀;紫外可变波长检测器. (2)色谱柱:Zorbax Ecplipse XDB-C8柱,长150 mm,内径4.6 mm,粒度为5m. (3)SPE固相萃取装置;SPE固相萃取小柱:填料为C18键合相500 mg,长6 cm;固相萃取抽滤装置. (4)荧蒽标准溶
4、液:质量浓度为33g/mL(国家标准物质研究中心提供). （5）荧蒽标准使用液:质量浓度为330g/L,吸取荧蒽标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度. （6）甲醇、二氯甲烷、异丙醇均为色谱纯;硫代硫酸钠;本实验用水均为二次蒸馏水,2. 结果与讨论 (1) 分别配制不同含量的荧蒽标准溶液, 按样品测定方法作校正分析, 得到不同的荧蒽峰面积, 以各组分的峰面积对浓度作图, 各点在试验范围内线性良好, 其线性回归方程为Area=0.038 182 5 Amount-0.333 916, 相关系数为0.999 9. (2)为了考察方法的精密度, 对几个浓度的样品进行了平
5、行测定, 得到其相对标准偏差为0.98%5.70%。 (3)最小检出浓度的测定: 在样品测定的色谱条件下, 待仪器稳定后, 记录空运行时的色谱图和数据, 打印信噪比报告, 按下式计算最小检出浓度:取1 000 mL水样, 本法的最小检出浓度为15.84 ng/L.,3.8.2.2酰胺型反相键合色谱法用于碱性物质的分离,1 仪器与试剂 （1）仪器HPLC色谱系统由日本岛津LC-10AD泵SPD-10A多波长紫外分光检测器Rheo-dyne7125进样阀江申色谱工作站JS-3000 （2）试剂Kromasil-5m硅球(孔径10 nm,比表面积340 m2/g)氨丙基三乙氧基硅烷(纯度99%,Fl
6、uka)辛酰氯(纯度99%,Fluka)甲醇(色谱纯,山东禹城化工厂)水(二次蒸馏,045m微孔膜过滤) 。,2. 酰胺型辛烷基键合固定相（AOBP）的制备,3.8.2.3 十四烷基胺键合固定相的反相色谱性能,3.8.3 反相离子对色谱,3.8.3.1 反相离子对色谱法测头孢他啶侧链酸含量 1 仪器和试剂 （1）仪器 岛津SPD-10AVP液相色谱仪; 紫外检测器; N2000色谱工作站; AS3120超声波振荡器;0. 45m过滤膜。 （2）试剂 乙睛; NaH2PO4 、NaOH; 溴化四丁基铵（反离子试剂）、聚氧化乙烯月桂醚； 对照品头孢他啶侧链酸(市售工业品纯度97% )。,2 色谱条
7、件 AlltechODS色谱柱, 250mm4. 6mm。 流动相:溶液A与溶液B以5: 8的比例混合后, 用2molL-1 NaOH 溶液调节pH值至7. 0+0.1, 并过滤、脱气; 其中: 溶液A为0. 8g溴化四丁基铵和1. 5 g 聚氧化乙烯月桂醚溶解于250mL乙腈中; 溶液B为0. 1molL-1NaH2PO4溶液。 检测波长: 263nm;流速: 0. 8molmin-1;柱温:室温。,3 标准曲线制备 精密称取一定量的对照品置于100mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,用超声波振荡溶解,然后用移液管精密移取5、10、15、20、25mL置于5个50mL容量瓶中,用流动相稀释至刻
8、度(其浓度分别为2.86,5.72,8.58,11.44,14.3mg/50mL)。分别取8L制备好的对照品溶液进行分析,以色谱峰面积为纵坐标Y,进样量为横坐标X(mg),绘制标准曲线,回归方程为:,4 试样分析 （1）试样溶液的制备 称取试样(本院研制的小试样品,为了使杂质峰更清晰,选取了研制过程杂质含量较高的样品)约0. 01g(精确至0. 0002g)置于50mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,用超声波振荡溶解。 （2）试样溶液的测试 取8L制备好的试样溶液进行分析。根据保留时间及加入对照品后峰高增加定性,依据标准曲线进行定量。色谱图见图1。,5. 精密度实验 取上述对照品溶液(14. 3
9、mg/50mL),在测定条件下进样8L(色谱图见图2),重复进样5次。以头孢他啶侧链酸的峰面积计算,其RSD为0. 12%,精密度很理想。,6. 回收率的测定 将头孢他啶侧链酸对照品定量加入已准确测定含量的头孢他啶侧链酸中,在选定的实验条件下,测其回收率,结果见表1。,7. 操作条件及注意事项 头孢他啶侧链酸是一个极性物质,用普通的反相色谱难以分离,采用离子对色谱可达到满意的分离效果。在样品峰的前面有未知杂质峰, 流动相采用水、乙腈溶液, 磷酸盐做缓冲溶液, 溴化四丁基氨做为离子对试剂。 流动相的pH值定为7, pH值过高、过低分离效果都不好。 检测波长选用263nm,曾用过254、260nm
10、,稳定性263nm最好。 由于流动相中含有无机盐, 容易析出结晶而堵塞或磨损色谱柱和仪器, 因此, 每次测试完毕要用水和甲醇充分冲洗仪器和色谱柱。,3.8.4 离子色谱法,3.8.4.1离子色谱法快速分析牙膏中多种阴离子含量 1 主要仪器与试剂 （1）仪器 ICS-1000型离子色谱仪 KH-400DB型数控超声波清洗器 SYZ-A型石英亚沸高纯水蒸馏器 XYJ-802型离子沉淀机 PXS-215型离子活度计 水系13 mm0. 22m一次性样品过滤器，0.22m过滤膜 1.00 mL RP型样品前处理柱。 （2）试剂 Na2CO3, NaHCO3, NaF, NaCl, NaNO2, NaB
11、r, NaNO3, CH3OH, Na3PO412H2O, 以上均为优级纯; 某品牌牙膏。,2. 仪器条件 离子色谱仪: 分析柱为AS14 (4 mm250 mm)阴离子交换柱,保护柱为AG14 (4 mm 50mm);淋洗液为过水系0.22m微膜的3. 5 mmol/LNa2CO3- 1.0 mmol/L NaHCO3溶液;流速为1.0 mL/min;色谱工作站为变色龙;进样量为25L; 抑制器类型为阴离子微膜自动再生抑制器ASRS; 检测器类型为电导检测器。,3.8.4.2离子色谱法测定地表水中六种无机阴离子,1仪器及试剂 （1）仪器 DX-600型离子色谱仪(美国戴安公司) GP50梯度
12、淋洗泵 ED50电导检测器 PeakNet IA色谱数据工作站 超纯水系统 配以Ionpac AG11-HC保护柱、Ionpac AS11-HC分离柱; ASRS-4MM抑制器。 （2)试剂 NaOH;F-标准溶液(1000 mg/L),Cl-标准溶液(1000mg/L),NO2-标准溶液(100 mg/L),NO3-标准溶液(100 mg/L), SO42-标准溶液(1000 mg/L),PO43-标准溶液(500 mg/L),均由国家标准物质研究中心提供。溶液均用电阻大于18.2 M超纯水配制。过滤膜为Auto-science 0.45m水系膜。,2. 色谱条件 AG11-HC (50 m
13、m4 mm)阴离子保护柱, AS11-HC (250 mm4 mm)阴离子分离柱; ASRS-ULTRA(4 mm)型阴离子抑制器; 抑制电流为59mA, 流动相淋洗液浓度为20 mmol/L NaOH, 流速1. 0 mL/min; 进样量为25L; 此时色谱系统压力为10 342. 5 kPa; 测定温度为1828。柱温为室温; 电导检测; 以保留时间定性, 峰面积定量。,3. 结论 采用ED50电导检测器,离子色谱法对地表水中常见阴离子的测定,在选定的色谱条件下,一次进样25L,可在15分钟内检测F-, Cl-, NO2-,NO3-, SO42-, PO43-六种阴离子,具有较高的灵敏度
14、和准确度,重复性好,该方法操作简便,具有较高的实用价值。,3.8.4.3 离子色谱法测定降水中常见阴离子,1. 仪器 Metrohm761型便携式离子色谱仪 电导检测器 离子色谱交换柱Metrosep Anion Supp 5(6. 1006.510); Millipore纯水系统; 万分之一电子天平; AutoScienceAL系列溶剂过滤器; 以顶端加滤芯(045m)的国产一次性医用注射器(2mL)作为进样器.,2. 色谱条件 流动相为40 mmol/L Na2CO3与10 mmol/L NaHCO3的混合溶液,真空抽滤(045m);流速为08 mL/min,等度洗脱; 阴离子抑制液为50
15、 mmol/L硫酸溶液和去离子水; 进样量为100L; 柱温为室温; 电导检测; 外标法以峰高或峰面积定量.,3.8.4.4免试剂离子色谱法测定饮用水中阴离子,1.仪器 美国戴安ICS-90离子色谱仪 Chromeleon6.40色谱工作站 ASll-HC色谱柱(4mmx250mm) MMSlll型抑制器 电导检测器 RFC-30淋洗液发生器,3.8.4.5 离子色谱法在油气田水分析中的应用,3.8.5 空间排阻色谱法,3.8.5.1 分子排阻色谱对蛋白质的分离 1. 仪器 Waters209型高效液相色谱仪 检测器为SPD-1型UV-vis可变波长检测器，检测波长=254 nm, 色谱柱为150mm400 mm i.d.不锈钢柱, ZTJ-型装填机。 2. 试剂 蛋白质标准品及样品(中科院西北生化制品厂), 硅烷化试剂-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(KH-560)。 其他试剂及溶剂均为分析纯。,3.色谱条件 检测波长UV,=254 nm; 流动相为pH6.9的磷酸盐缓冲液(0.05 ol/L NaH2PO4 + 0.05 mol/L Na2HPO4+0.2 mol/L NaCl); 流速0.8mL/min; 等度洗脱; 室温。,
