1、 METAFECTENE PRO 中文说明书适用于哺乳动物细胞运输：室温运输（收到后冷冻保存）保存：小于-15 度保质期：推荐使用期日之前（见标签）使用：只用于体外实验，不适用于人或动物的诊断、治疗、临床研究。产品描述：METAFECTENE PRO 是最新一代的哺乳动物细胞转染试剂的新标准。它融合了biontex 公司的 RMA（斥膜酸解）技术和 TOP(毒性最优)技术，这些技术能调控脂质体在细胞内释放遗传物质，使得一方面，细胞毒性影响是最小的，另一方面，最大限度提高了DNA 质粒在胞奖中的浓度和被核摄取的几率。之前很多文献得出结论是 METAFECTENE 在转染效率上和 METAFECT
2、ENE 相差不大，但是针对比较难转和非常难转的细胞，METAFECTENE PRO表现更优越的特性。1.基本信息1.1 规格适用类型 转核酸物质进入哺乳动物成分 阳离子脂质体和胶质溶于水是否无菌 检测无菌是否用于细胞培养 验证过使用寿命 1 年保存条件 -15 度冷冻1.2 质量控制标准的转染试剂包装，没有细菌和真菌污染，已经采用硫基乙酸盐培养基证实过。1.3 有效期标签METAFECTENE PRO 提供的是 ready-to-use 的即用液，它没有血清抑制特性，因此它是转染敏感细胞的最佳选择。保存METAFECTENE PRO 常温运输，收到之后立即存放于 -15 度下冷冻保存。冷冻状态
3、能最小减低脂质体老化过程。短暂几天在室温状态对它影响不大，但切忌避免反复冻融。细胞状态用于转染的细胞必须是处于生长对数期，细胞在对数生产期之前（细胞密度大约30%-60%）有一段静止期，这个期间不太适合做转染，因此，推荐用传代细胞来做转染实验。微生物的污染如支原体、真菌能破坏转染的结果，biontex 提供 MYcoSPY 和MYcoRAZOR 用于快速检测和去除支原体的污染。细胞密度真实的细胞密度做转染不能简单通过显微镜下观察来评估，而需要做光学检测做标准曲线和对比细胞计数。一个好的转染结果获得必须建立在细胞密度大概为 90%-100%，通常相对于转 DNA 而言，转染 siRNA 是不依赖
4、于细胞分裂的，因此需要细胞密度会小一些。优化尽管 METAFECTENE PRO 可以适用于很多细胞类型又有很好的转染特性，但是如果我们适当优化转染条件例如质粒、细胞株等比例，可能会得到更接近于我们想要的结果。每种细胞有自己的最优 DNA/RNA/siRNA-lipo 的比例，培养的器皿、脂质体复合物的形成和细胞状态都能影响到最终吸收的转染试剂的量。此外，用于别的转染试剂的实验方法不能照搬用于METAFECTENE PRO，任何转染试剂都有其自己独特的分子结构和独特的物理特征，不能笼统用一种方案来做。适当优化的说明在第 3 部分给出。当然，在这些因素中，只有微小的优化是必须的如果您的实验都考虑
5、这些因此的干扰的话。DNA/RNA/siRNA 最好使用高纯度级别的。因为内毒素能削弱转染效率，举例来说，在这之前 DNA/RNA/siRNA 被用于脂质体复合物 METAFECTENE PRO，那么 DNA/RNA/siRNA 保存在稀释的培养基中不能超过 5min。容器材料表面的小孔能吸收 DNA/RNA/siRNA 导致转染效率大幅降低。聚丙烯材料显示是最低吸附转染试剂和遗传物质的。稳定转染如果你想得到很漂亮的转染结果，请按照下面操作指南来接种较低密度细胞。在开始转染那天起，细胞密度应不少于 50%，完成转染操作步骤后，用适当的含有抗生素培养基取代转染用的培养基。2.操作指南2.1 转染
6、贴壁细胞标准操作方法-12 孔板 （我们推荐起点按我们的提到的起点，优化按 P10 条件优化）1.在 12 孔板中，接种 1.0-4.0*105（起点为 2.0*105）每个小孔接种细胞 1ml，悬于新鲜的完全培养基中。2.孵育细胞于 37 度 CO2 培养箱中，直到细胞达到为 90%-100%的融合，这个时间会有差异，一般来说需要花 18-24h3.将保存的 DNA/RNA/siRNA 和转染试剂取出，保持到室温。做到快冻慢升温。4.准备接下来的溶液稀释，用 96 孔细胞培养板或者其他的低吸附的小管，推荐使用聚丙烯塑料材料。必须先用枪头加入培养基，高纯度的液体不能直接接触塑料表面。 溶液 A
7、 0.5-1.5ug DNA/RNA 溶于50ul 无血清和无抗生素培养基或者 PBS 溶液溶液 B 1.0-7.0ul METAFECTENE PRO 溶于50ul 无血清和无抗生素培养基或者 PBS 溶液温馨提示：DNA/RNA:脂质体比例=1：1 ug DNA/RNA:ul METAFECTENE PRO=1:7比率需要优化的其他影响因素见第 3 和 4 部分增加液体 A 的体积，相应增加液体 B 体积，不可以将比例搞反。5.尽可能的轻柔缓慢用枪头吹打一次将溶液混合。6.将溶液 A 和溶液 B 混合，尽可能的轻柔缓慢，用枪头吹打一次将溶液混合。室温孵育 15-20min。温馨提示：剪切压
8、力会破坏 DNA/RNA-lipo 复合物就如 DNA 双联一样。7.孵育完之后，将 AB 混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，置于 37 度 CO2 培养箱。8.根据细胞类型不同，增强活性不同、细胞提取基因的活性不同，24-72 小时后启动转染。2.2 转染悬浮细胞-标准方法1.在 12 孔板中，接种 1.0-4.0*105（起点为 2.0*105）每个小孔接种细胞 1ml，悬于新鲜的完全培养基中。2.将保存的 DNA/RNA/siRNA 和转染试剂取出，保持到室温。做到快冻慢升温。3.准备接下来的溶液稀释，用 96 孔细胞培养板或者其他的低吸附的小管，推荐使用聚丙烯塑料材料。必须先用
9、枪头加入培养基，避免高纯度的液体直接接触塑料表面。溶液 A 0.5-1.5ug DNA/RNA 溶于50ul 无血清和无抗生素培养基或者 PBS 溶液溶液 B 1.0-7.0ul METAFECTENE PRO 溶于50ul 无血清和无抗生素培养基或者 PBS 溶液温馨提示：DNA/RNA:脂质体比例=1：1 ug DNA/RNA:ul METAFECTENE PRO=1:7比率需要优化的其他影响因素见第 3 和 4 部分增加液体 A 的体积，相应增加液体 B 体积，不可以将比例搞反。4.尽可能的轻柔缓慢用枪头吹洗一次将溶液混合。5.将溶液 A 和溶液 B 混合，尽可能的轻柔缓慢，用枪头吹洗一
10、次将溶液混合。室温孵育 15-20min。温馨提示：剪切压力会破坏 DNA/RNA-lipo 复合物就如 DNA 双链一样。6.孵育完之后，7.孵育完之后，将 AB 混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，置于37 度 CO2 培养箱。7.根据细胞类型不同，增强活性不同、细胞提取基因的活性不同，24-72 小时后启动转染。2.3 转 siRNA 最初优化方案 -以 24 孔板为例1.在 24 孔中按每孔接种 0.1-1.0*105 细胞，悬于 0.5ml 新鲜完全培养基中。对于大多数类型细胞，达到 30%-50%的融合，可以开始转染实验。2.将保存的 DNA/RNA/siRNA 和转染试剂取
11、出，保持到室温。做到快冻慢升温。3.准备接下来的溶液稀释，用 96 孔细胞培养板或者其他的低吸附的小管，推荐使用聚丙烯塑料材料。必须先用枪头加入培养基，避免高纯度的液体直接接触塑料表面。SiRNA-lipo 与 METAFECTENE PRO 混合比例Tube R1 R2 R3 R4siRNA 0.1ug(Ca.7.5pmol)0.2ug(Ca.15pmol)0.5ug(Ca.40pmol)2.0ug(Ca.150pmol)加无血清培养基或者 PBS 30ul 30ul 30ul 30ulTube M1 M2 M3 M4METAFECTENE PRO 0.5ul 1ul 2.5ul 10ul加
12、无血清培养基或者 PBS 40ul 40ul 40ul 40ul温馨提示：增加 siRNA 的体积，相应增加 METAFECTENCE PRO 的体积，不可将比例搞反。4. 尽可能的轻柔缓慢用枪头吹洗一次将溶液混合。5. 混合溶液 R1+M1,R2+M2,R3+M3,R4+M4，尽可能的轻柔缓慢，用枪头吹洗一次将溶液混合。室温孵育 15-20min。6.孵育完之后，这时 siRNA-lipo 复合物逐滴进入细胞，小心将培养板摆动混匀，置于 37 度CO2 培养箱。温馨提示：剪切压力会破坏 DNA/RNA-lipo 复合物就如 DNA 双链一样。7.根据细胞类型不同，siRNA 稳定性不同、mR
13、NA 稳定性不同和目的蛋白不同、研究基因knock-down 不同，一般在 24-72h 开始转染，一旦 siRNA-lipo 复合物加入细胞，没必要清洗去除，直接换液即可。温馨提示：要想获得高效率的和低非特异性影响，优化转染条件通过改变 siRNA 和 lipid 的浓度来实现。2.4 共转染实验（siRNA-DNA）METAFECTENE PRO 在共转染短暂抑制 RNA 和质粒 DNA 效果也很不错。通常而言，质粒转染需要高的细胞密度，对比与 siRNA 转染而言，因此我们推荐：1.细胞接种密度和时期按照转染 DNA 的方法2.按照 siRNA 转染一样的比例，对应调节脂质体总量-核酸总
14、量的比例，如果你想增加总的核酸量，对应成比例增加 METAFECTENE PRO 的量。3.通常使用的 METAFECTENE PRO 的体积（ul）至少是最终核酸质量（ug ）的 2 倍以上。3.优化指引3.1 关键的优化参数METAFECTENE PRO 和 DNA/RNA/siRNA 比率最重要的优化参数是 METAFECTENE PRO 和 DNA/RNA/siRNA 的比率，一种成功的转染试剂是带少量正电荷的 DNA/RNA/siRNA-METAFECTENEPRO 复合物，DNA/RNA/siRNA-METAFECTENE PRO 比率依赖于细胞系。高质量的转染复合物为了获得高质量
15、的转染结果，优化吸收的 DNA/RNA/siRNA-lipo-complex 是必须的。优化 DNA/RNA/siRNA-METAFECTENEPRO 比率和 DNA/RNA/siRNA-lipo-complex 的浓度可能会随之改变细胞数量。过多的复合物能导致超表达或者细胞溶解（脂质体本身是溶解试剂）因此必须保持接种细胞数量和孵育期的稳定直到转染过程可以再度优化这些参数。接种细胞数量见 5.2 部分血清的影响然而，几乎所有的细胞系用 METAFECTENE PRO 来转都表现漂亮的结果即使是培养基中含有血清的情况下，但是特殊的细胞可能显示不同的特性。因此，转染可以在无血清条件，也可以在少量血
16、清或者 10%的血清下进行。在 DNA/RNA/siRNA-METAFECTENEPRO 复合物形成过程中严禁使用使用血清。血清可能抑制复合体形成，一旦复合体形成之后，再接触血清是可以的，优化DNA/RNA/siRNA-METAFECTENEPRO 比率和 DNA/RNA/siRNA-lipo-complex 的浓度可能会随之改变血清浓度。优化这些关键因素通过接下来的优化指引（见 3.3）3.2 进一步优化参数转染复合物的孵育时间细胞暴露在转染复合物在一个可以变化的时间段（3-72h）依赖于转染细胞的敏感性。长短都是可以的。转染和评估时间段评估一个基因的活性将在完成转染之后 24-72h 内完
17、成，优化时间依赖于细胞类型、增强活性、表达产物。用 PBS 在 DNA-lipo 复合物形成代替无血清培养基无数实验表明用 1*PBS 在 DNA/RNA/siRNA-lipid 复合物形成代替无血清和无抗生素的培养基使得转染效率大大提高，甚至成倍提高，尤其是用少量的脂质体的时候。见 6.1.3.3 优化操作说明为了说明优化目的，我们拿报告基因质粒如：PCMV Gal、Pnd2Luc、pEGFP 等来举例： 1. 根据操作指引：改变 METAFECTENE PRO 的数量在间断的目的的表格中（例如：2ul、4ul 、6ul、8ul 、10ul、12ul 等等） 。保持细胞转染开始时的细胞数量和
18、 DNA/RNA 数量的恒定在推荐的起点。孵育 DNA/RNA-lipo 复合体过程中血清浓度要和细胞培养过程中血清浓度一致。2. 根据操作指引：改变 DNA/RNA 的数量（例如：1ug、1.5ug、2ug、2.5ug、3ug 等等）保持这个间格的 METAFECTENE PRO 成比例见 3.3.1，同时，保持在转染开始时的细胞数量恒定在推荐的“起点”状态。孵育 DNA/RNA-lipo 复合体过程中血清浓度要和细胞培养过程中血清浓度一致。测定 DNA/RNA 和 lipo 的比例。3. 重复 3.3.1 和 3.3.2 用少量的血清和无血清的条件4. 重复 3.3.1 和 3.3.2 用
19、其他的细胞转染开始时的细胞数量的“起点”以 12 孔板举例1. 在 12 孔板中，接种 1.0-4.0*105（起点为 2.0*105）每个小孔接种细胞 1ml，悬于新鲜的完全培养基中。2. 将细胞孵育在 CO2 培养箱 ,37 度, 直到细胞融合达到 90%-100%,这个时间根据不同细胞类型不同, 通常为 18-24h3. 将保存的 DNA/RNA/siRNA 和转染试剂取出，保持到室温。做到快冻慢升温。4. 用枪头吸取 50ul 无血清无抗生素培养基或者 PBS 到 96 孔板的小孔,接着加入:0.5ug DNA(RNA) in A1-A41.0ug DNA(RNA) in B1-B41
20、.5ug DNA(RNA) in C1-C4小心吹洗一次,混合均匀.5. 用枪头吸取 50ul 无血清无抗生素培养基或者 PBS 到 96 孔板的小孔,接着加入:1.0ul 2ul 4ul 6ul METAFECTENE PRO in D1-D42.0ul 4ul 8ul 12ul METAFECTENE PRO in E1-E44.0ul 8ul 12ul 16ul METAFECTENE PRO in F1-F4小心吹洗一次,混合均匀.6. 混合这些对应的孔(A1+D1,A2+D2,A3+D3,A4+D4) (B1+E1,B2+E2, B3+E3,B4+E4)(C1+F1,C2+F2,C3
21、+F3,C4+F4), 小心吹洗一次, 混合均匀,在室温孵育 15-20min.注意吹洗动作要轻缓缓,剪切力会破坏脂质体。7. 孵育完之后，将以上混合液逐滴加入含有细胞的悬液中，摇动培养板，轻轻混匀，置于 37 度 CO2 培养箱。8. 根据细胞类型不同，增强活性不同、细胞提取基因的活性不同，24-72 小时后启动转染。如果结果满意，将剂量上调或者下调根据不同的容器详见第 4 部分4.剂量上调与下调1.在大多数情况下，DNA/RNA/siRNA:METAFECTENE PRO 的最佳比率在 1：2 和 1：7 之间2.对 siRNA 采用独特的 siRNA 优化的方法，用 24 孔板的生长面积
22、的大小来成比例地评估出你使用小孔尺寸所需要使用的剂量。3.不同品牌的器皿材质对吸收的 lipolex 数量和 DNA/RNA/siRNA-lipid 的比率不同。以 24 孔板为例，优化 DNA 和 METAFECTENE PRO 的比率培养板直径（mm ）7（96 孔板） 16(24 孔板) 22（12 孔板） 35（6 孔板） 60 100生长面积（cm2 ）0.31 1.9 3.7 9 22 60比例系数 0.03 0.2 0.4 1.0 2.5 6.7接种贴壁细胞数量0.10-0.60(0.12)0.4-2.0(1.0) 1.0-4.0(2.0) 2.5-10.0(5.0) 6.0-2
23、4.0 15.0-60.0(25.0)悬浮细胞数量 0.04-0.24(0.12)0.16-0.8(0.8) 0.4-1.6(0.8) 1.0-4.0(2.0) 2.4-9.6(4.8) 6.0-24.0(10.0)悬浮细胞体积 0.15 0.5 1.0 2.0 4.5 12.0DNA/RNA 质量（ug）0.04-0.3(0.1) 0.08-1.0(0.5) 0.2-2.0(1.0) 0.4-5.0(2.0) 0.8-12.0(6.0) 1.6-34.0(14.0)METAFECTENE pro 体积0.2-4.0(0.6) 0.4-7.0(2.0) 0.8-15.0(3.0) 1.6-35
24、.0(0.6) 3.2-90.0(18.0) 6.4-250(42.0)稀释的 DNA/ RNA 体积15-30 30 50 100 300 700稀释的METAFECTENE pro 体积10-50 10-50 50 100 300 700总的混合液体积 0.175-0.23 0.54-0.58 1.1 2.2 5.1 13.4以 24 孔板为例，不同细胞类型每孔所含 DNA 数量差异细胞类型 0.1ug 0.2ug 0.3ugBHK 1；3 1：3 1：3CV-1 1：3 1：3 1：3COS-7 1；2 1；2 1：2MDCK 1：3 1：3 1：35.问题与解决1.避免任何接触纯的 M
25、ETAFECTENE PRO 和纯的 DNA/RNA/siRNA 溶液直接接触塑料材料。应先加入无血清或者 PBS，在 5min 内完成溶液稀释，形成复合体。2.通常来说，在显微镜下观察得出细胞融合是细胞占整个瓶子底部面积的百分比，不等于实际上测出的生长曲线，最好的转染结果获得细胞密度大概是真实细胞融合为 30%-60%（通过生长曲线测出）显微镜下目测为 90%-100%3. DNA/RNA/siRNA 和 METAFECTENE PRO 稀释在无血清培养基中，在 5min 内将两者混合。4.细胞增殖减缓和细胞毒性与转染的高表达相关，这种高表达可以通过提高接种起点时的细胞融合或者降低转染时 D
26、NA/RNA/siRNA-METAFECTENE PRO 复合物浓度实现。5.不要添加抗生素，否则会引起细胞死亡或者降低转染效率。6.万一转染的是一种很娇贵的细胞，建议转染完成后 3-6h 将转染试剂复合物用培养基洗掉，换成完全培养基。6.其他6.1 PBS10*PBS （ 40g Nacl 1g KH2PO4 1g KCl 5.75g Na2HPO4 溶于 500ml 无菌水，灭菌备用。 ）1*PBS （10*PBS：H2O=1：9 稀释）6.2 重要信息METAFECTENE 是 biontex 公司注册的商标，optiMEM 是 invitrogen 公司注册商标。Biontex公司产品
27、 METAFECTENE PRO 仅适用于体外实验研究，不能用于人的诊断和治疗，当您使用它发表公开文献时敬请留意。6.3 保质期Biontex 公司保证 METAFECTENE PRO 产品质量稳定可靠，和已经发表文献报道是一致的，购买后 12 个月是其最佳使用期，如果您对该产品的某些性能不满意，请您和中国当地代理商深圳市库源生物公司取得联系。7.相关产品货号 产品名称 规格 价格 注备T030-0.5T030-1.0INSECTOGENE 0.5ML1.0ML￥2000.00￥3600.00适用于 DNA 转染昆虫细胞，与杆状病毒表达系统兼容T040-0.2T040-1.0METAFECTE
28、NE PRO 0.2ML1.0ML￥860.00￥4100.00适用于 DNA 转染哺乳动物细胞T100-0.2T100-1.0METAFECTENE SI 0.2ML1.0ML￥860.00￥4100.00适用于 siRNA 或 miRNA 转染哺乳动物细胞T090-0.1T090-2.0METAFECTENE EASY+ 0.1ml1.0ml￥1440.00￥5600.00第三代转染试剂快速、简单、高效T050-0.5T050-1.0METAFECTENE FluoR 0.5ml1.0ml￥3200.00￥5860.00适用于 DNA 转染真核细胞转染过程可视化K010-015K010-1
29、00-Transfetion kit 15ul+1.5mlPBS100ul+10mlPBS询价询价带有高光学性能的培养小室，可以直接做激光共聚焦成像。E010-0.1E010-0.25Proteofectene AB 100ul250ul￥4000.00￥9800.00抗体转染真核细胞T120-0.25T120-0.5METAFECTENE 3D HG 250ul500ul￥3000.00￥5760适用于 DNA 转染，用细胞基质、明胶、海绵等 3D 培养载体哺乳动物细胞T110-0.25T110-0.5METAFECTENE 3D SC 250ul500ul￥3200.00￥6120.00适用于 DNA 转染哺乳动物细胞，用水凝胶、透明质酸、PEG、胶原蛋白等 3D 培养载体哺乳动物细胞
