1、中文使用说明书North2South 生物素标记和化学发光检测试剂盒目录号: 17175 （17075，37549，37555，89880 ） 该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成17075（探针标记，纯化和定量）North2South生物素随机引物 Kit(该试剂盒含有足以完成 10 次标记反应的试剂，每次可合成至少 1ug 的生物素标记的探针)产品名称：货号 产品描述17075 North2South生物素随机引物Kit10次标记反应，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) Kit 组分 : Heptanucleotide mix (5X), 100 l dNTP mix
2、 (5X) (1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP, dCTP), 80 l Reaction Buffer (10X), 50 l DNA Polymerase, Klenow fragment (3-5 exo-),(10 units/l), 10 l Non-biotinylated control DNA*, (250 ng/l), 5 l EDTA, (500 mM, pH 8.0), 1 ml Nuclease-free water, 1 ml NH4OAc, (5 M), 1 ml Biotin-N4-dCTP, 20 l 储存条件： 所有试剂应该在无霜
3、冷冻20冰箱保存探针标记：操作步骤：将 20ul 生物素标记的 N4-dCTP 与 80ul 的 5XdNTP 混合物充分混合备用（总量 100ul）1. 稀释约 100ng 线性探针模板至 24ul 于离心管中 (模板 DNA 要定量和纯化)2. 加入 10ul 随机引物（Heptanucleotide mix）于上述离心管中，煮沸变性 5 分钟，迅速在冰水混合物退火 5 分钟3. 加入 10ul N4-dCTP 与 5XdNTP 的混合物，5ul 反应缓冲液，1ul Klenow 酶片断，混匀4. 37孵育 60 分钟5. 加入 2ul EDTA 以灭活 Klenow 酶活性探针纯化操作步
4、骤：1. 加入 5ulNH4OAC 于上述 50ul 反应离心管，吹打混匀2. 加入 110 ul 冰预冷的无水乙醇，充分混匀，冰或70放置 15 分钟3. 12000rpm 4离心 15 分钟4. 观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀5. 用冰预冷的 70乙醇洗涤一次，12000rpm 4离心 15 分钟，观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀6. 50ulTE 或 RNA 酶 free 的水溶解沉淀（20或70 长期保存）探针定量（17075 ）操作步骤：1. 500ul 去离子水，260nm 调零2. 充分混匀 2.5ul 探针和 47.5ul 去离子水（即稀释 20 倍）分光光度计测
5、定 OD260值3. 定量计算公式：1 OD260 dsDNA = 50 g/ml； 样品浓度（g/ml）=OD 值 X50X 稀释倍数; 样品浓度 g/ul= OD260值 X50X20/1000样品浓度 ng/ul= OD260值 X50X20（注：如果稀释 20 倍，实际测定的 OD260值应该在 0.020.05 之间）Note:大多数情况下，由于各实验室用来测定核酸的仪器不同，检测灵敏度不同以及样品中的一些干扰物质，测出的 OD 值往往是 0 甚至是负值，如果出现这种情况，再进行核酸定量没有实际价值，因此，根据经验，保守估计，在每次至少合成 1ug 探针的前提下，在杂交时，探针的用量
6、按照每 ul 含有 20ng 探针来使用，即每毫升杂交液加入变性的纯化过的探针 1.5-2ul.杂交和洗膜产品名称：杂交缓冲液和严谨洗膜缓冲液货号 产品描述37549North2South Hybridization Buffer Component, 125 ml37555 North2South Hybridization Stringency wash Buffer（2X）, 375 ml储存条件：4 点杂交；样品转膜（带正电尼龙膜） 使用前将所有试剂放到室温下，保证所有 buffer 溶解充分，没有颗粒。 调节烘箱和温箱至适当杂交温度（DNA 杂交 55 ，RNA:RNA 杂交 65）
7、 处理膜时只能用干净的镊子小心夹住膜的边角。我们建议在两个操作步骤间用乙醇清洗镊子并干燥待用。杂交和第一次洗膜之间改换洗膜容器和将使膜更干净。 杂交、洗膜和检测时不能让膜干燥。杂交具体操作步骤：1 平衡杂交液到室温2 预杂交:将转好的膜置于杂交管，点样面朝上，确保膜被杂交缓冲液均匀覆盖，杂交炉要缓慢转动以保证杂交液与膜能充分接触，（每平方厘米膜至少 0.1ml 杂交液。除了 RNA:RNA 杂交用 65外，其他的都用 55）,50-100rpm 旋转，至少 30 分钟。3 热变性探针：煮沸变性 10 分钟，迅速在冰 /盐水混合物退火 5-10 分钟4 杂交：加入已经变性的 DNA 探针于杂交液
8、，充分混匀（探针加入到杂交液，不要加到膜上，要轻轻晃动，使探针均匀分散在杂交液中） ，探针浓度约 30ng/ml 杂交液, 50-100rpm 旋转，孵育过夜。严谨洗膜 配制 1X 严谨洗膜缓冲液（North2South Hybridization Stringency wash Buffer（2X）120ml(1:1 配比)1 平衡严谨洗膜缓冲液到室温（溶解充分） ，加等体积去离子水配制所需洗膜液（0.2ml/cm 2膜）2 将膜转移到一个新的容器中（杂交管） 。加入 1X 严谨洗膜液10 20ml，旋转洗膜 3 次（DNA 杂交 55，RNA:RNA 杂交65） ，每次 1520 分钟。（
9、化学发光检测）：检测 1080cm2的杂交膜产品名称：化学发光核酸检测试剂盒货号 产品描述89880 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection ModuleStabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugateed, 1.5mLNorth2South Luminol/Enhancer Solution, 80 mlNorth2South Stable Peroxide Solution, 80 mlNorth2South Blocking Buffer, 500mLNorth2South Wash
10、Buffer(4X), 500mLNorth2South Substrate Equilibration Buffer, 500mL储存条件：4检测步骤： 预先缓慢温育 blocking buffer(封闭液 )和 4X washing buffer(漂洗缓冲液) （ 3750溶解,此 2 种缓冲液可以在 RT-50使用）,底物平衡液(substrate equilibration buffer)可以在 4-RT 使用，要保证所有缓冲液充分溶解，没有颗粒 配制 1X 漂洗缓冲液（washing buffer）120ml(1:3 配比)具体操作步骤（封闭，抗体孵育，洗膜，平衡，底物孵育，曝光）1
11、. 封闭：弃严谨洗膜液，加入足够封闭液 20ml（0.25ml/cm 2膜） ，37 50振荡洗膜封闭 15 分钟2. 抗体稀释液配制（1：300）：66.7ul 稳定的链亲和素标记的HRP（SSHP） 20ml 封闭液3. 抗体孵育：弃封闭液，加入 20ml 抗体稀释液，室温轻柔振荡孵育15 分钟4. 洗膜：用 20ml 的 1X 漂洗缓冲液淋洗杂交膜，然后再用 20ml 漂洗缓冲液分别室温轻柔振荡漂洗 4 次，每次 5 分钟5. 平衡：将杂交膜转移到一新的干净容器，用 30ml 的底物平衡液室温轻柔振荡孵育 5 分钟6. 底物工作液配制：1：1 等体积混合 North2SouthTM Lu
12、minol/Enhanser 溶液和 North2SouthTM过氧化物酶稳定溶液作为化学发光的工作溶液。底物工作溶液需足够以完全覆盖杂交膜（约 0.1ml/cm2） 。注：该工作溶液在室温下至少能稳定 6 个小时。7. 底物孵育：把湿润的膜放在一个干净的塑料盘（平皿）里，与North2SouthTM底物工作溶液在室温下孵育 5 分钟（推荐在暗室中）。确保膜被底物溶液完全淹没或覆盖8. 把底物从膜表面清除掉（滤纸吸附） ，作好标记，并把湿润的膜转移到干净平整的保鲜膜上，再在上面覆盖一层保鲜膜，清除保鲜膜和杂交膜间的气泡和皱褶，吸干边缘的溶液。9. 曝光：把包好的杂交膜放在暗夹里，放上 X 光片
13、，曝光 15 分钟。曝光时间长短可以稍有变化以获得理想的信号。10. 从暗夹里取出 X 光片，按厂家的使用说明书显影和定影。 可与底片背景去除试剂配合使用，以获得更理想的实验结果附：对照 DNA 点杂交1.备用试剂：0.1N NaOH2.DNA 变性成单链（ 对照 DNA，5l，250ng/l ）在 1.5ml 无 DNAse/RNAse 的离心管里加入 0.8l（200ng）对照DNA（或样品，探针模板）和 20l 无核酸酶的水，得到浓度为10ng/l 的 DNA 溶液。煮沸变性 510 分钟，冰浴 5 分钟。3准备生物素标记的对照探针或阳性样品探针（见探针标记，纯化和定量）4.准备目标膜（
14、注意：推荐使用带正电尼龙膜，需带无粉手套并用乙醇净化的镊子拿膜。 ）a. 用 45l 0.1N NaOH 稀释 5l 的变性 DNA 得到 1ng/l 产物，并用 0.1N NaOH（1 ，0.5 ，0.25，0.125，0.0625，0.0312 ，和0.015ng/l）进行梯度稀释。b. 在膜上每个浓度梯度点 1l 样品，每个样品点两点。点前最好把膜预洗一下，半干的时候点，但干点同样有用。c. 用 1X TE 轻轻漂洗膜（10 秒） ，微波炉高火加热 2 分钟，紫外交联（自动交联）或烘干固定。注：如果没有紫外交联仪，则可以将膜置于 80 度温箱烘烤 23 小时，可达到固定目的d. 交联固定
15、完，用 0.1SDS 预湿润膜，进入下面预杂交，杂交以及底物孵育和曝光5 杂交，严谨洗膜和封闭，抗体孵育，洗膜，平衡，底物孵育以及曝光见前所述 Trouble shooting guide问题 原因 解决方法出现斑块/点 1） 在酶、缓冲液、 1） 放到适当温度。离心或底物中有不溶颗粒2） 未稀释探针接触到了膜3） 手套上的粉尘4） 膜上的气泡或过滤去除颗粒。2） 注意不要把探针打到膜上3） 带不含粉末的手套4） 用缓冲液和底物均匀覆盖膜。高背景 1） 探针浓度过高2） 太多 HRP3） 未稀释的探针接触膜4） 错误的封闭液或杂交液5） 漂洗液溶解不完全6） 膜7） 预杂交不完全8） 印迹纸1
16、） 降低探针浓度2） 增加 HRP 稀释度3） 探针加到杂交液里4） 检查5） 预先拿出平衡6） 带正电的尼龙膜7） 增加预杂交时间8） 膜下面用合格的滤纸（即 3MM）无信号 1） 标记失败或探针降解2） 曝光时间太短3） 转膜失败，错误1） 检查2） 延长曝光时间3） 用 EtBr 染色确证转膜膜4） HRP 失活或浓度不适当5） 严谨洗膜不够6） 探针太少7） 探针变性不完全8） 靶 DNA/RNA 降解9） 靶 DNA/RNA 浓度太低10）靶 DNA/RNA 变性不完全11）靶 DNA/RNA 固定不恰当12）探针丢失在塑料品上13）膜干了14）漂洗液没有稀释4） 用底物检测探针活性5） 0.1X 或增加温度6） 增加探针浓度7） 10010 分钟，骤冷5 分钟8） 检查均一性9） 增加靶 DNA/RNA浓度，10）转膜前充分变性靶DNA/RNA11）固定前用 1X TE 或水轻轻漂洗膜12）使用低吸收率的塑料13）始终保持湿润14）稀释到 1 倍出现非特异性条带1） 探针过量2） 洗膜严谨度不够3） 杂交温度不正确4） 靶 DNA/RNA 降1） 降低探针浓度2） 0.1X 或增加温度3） 检查温度4） 降低靶 DNA/RNA解或过量5） EtBr 或胶污染妨碍杂交浓度5） 用 1X TE 或者 0.1 SDS 宽泛洗膜2007 年 8 月 8 日星期三
