1、层析法：利用混合样品中，不同物质在固定相和流动相中的分布程度不同而进行分离的方法称其为层析法（或色谱法） 。特点：应用范围广；可对物质进行定量、定性和纯度鉴定；柱层析（column chromatography）将固定相装于柱内，使样品在层析柱中进行分离。纸层析（paper chromatography）用滤纸作液体的载体（担体 support） ，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析（thin layer chromatography）将适当粒度的吸附剂在玻璃板上铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定分配定律：分配系数 K=试样在固定相中的浓度/ 试样在移动相中的浓
2、度=C AS/CAM（1） 在定温、定压下，在一定的溶剂系统中，一定的物质其 K 值保持不变，不同的物质其 K 值不同（2） 当温度、压力或溶剂系统改变时，对于一定的物质来说，其 K 值也随之改变（3） K 值大于 1，物质在 S 相中的浓度大于其在 M 相中的浓度，反之则小分配比率（容量因子） k=化合物在固定相中的量/化合物在移动相中的量 =p/qK=（ p/Vs）/(q/Vm) （G=k）=K Vs/Vm容量因子与溶剂系统的组成、体系的温度、压力有关，还与两相的体积比值有关理论塔板数 N 及理论塔板高度 HETP=L（柱长）/N 影响因素 HETP=Cmd2u/Dm Cm 溶质分子的浓度
3、；d 固定相颗粒直径；u 流速；Dm 溶质分子的扩散系数高流速可以高样品输出性和高产量；低流速可提高分辨率影响分离的因素：洗脱曲线的参数分离度 Rs分离系数 （代表了两个物质在相同的色谱条件下的分离选择性样品区带扩散的因素：柱内扩散（涡流扩散、纵向扩散、传质速率） 、柱外扩散（样品、层析介质、装柱、层析条件、死体积）塔板理论：分配系数大的组分，每次达到平衡的时间长，从层析柱中后流出。一个层析柱的塔板数越多，分离次数越多，柱效越高理论塔板高度 HETP=Cmd2u/DmCm 溶质分子的浓度d 固定相颗粒直径 u 流速Dm 溶质分子的扩散系数聚焦层析（chromatofocusing ）它是根据蛋
4、白质的等电点的差异与蛋白质的离子交换作用进行分离纯化的。适用于分离某些蛋白质分子量和极性方面的性质十分接近，而等电点有区别的物质特点： 离容量大（能分离几百毫克蛋白质样品） 辨率很高（有洗脱峰被聚焦效应浓缩，峰宽度可达 0.04-0.05pH 单位）； 作简单（不需特殊的操作装置）从分离的蛋白质中去除多缓冲剂的方法：沉淀法。凝胶过滤法、亲和层析法、疏水层析法。亲和层析 AC（Affinity Chromatography）：根据生物分子间亲和吸附和解吸的原理建立起来的色谱法，生物大分子的专业结合作用（抗原和抗体、酶和底物及辅酶、酶和抑制剂、激素和受体、外源凝集素和糖蛋白、RNA 和其互补的 D
5、NA 等）特点：分离迅速、操作简便；可一步纯化；专一性强；缺点是使用局限性大。必要条件：合适的配体（配基、ligand）：亲和力大、具有解离平衡、与载体偶联不失活。 （亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称为配基）配体的浓度：一般使用较高的固定化配体浓度；当配体亲和力高，且本身带电则固定化配体浓度须降低。合适的载体（Matrix）：条）件（亲水、惰性、具有活化基团、大网孔、机械性能好 适的吸附和洗脱条件。e.g.谷胱甘肽转硫酶的分离：固相载体：琼脂糖凝胶（Sepharose 4B） ，配基为酶的底物之一（还原型谷胱甘肽） ，条件：碱性凝胶层析 GPC： 是采用具有分子筛效应的多孔凝胶作为固定相，
6、对分子大小及形状不同的物质进行分离的一种液相层析方法。大分子跑得快特点： 备简单、操作方便 分离的分子量范围广泛（102-107）； 胶完全惰性，且亲水； 脱条件温和； 析后柱无需再生处理，可反复使用。分配系数 Kd=凝胶内部溶质的浓度/凝胶外部溶质的浓度， 0Kd1影响因素：柱长（静水压：串联层析、循环层析）凝胶颗粒大小样品（体积、粘度）洗脱溶液（水，缓冲溶液）葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶 交联丙烯基葡聚糖凝胶离子交换sephadexSepharos200-800000，耐碱惰性，空较小，耐热，不耐酸惰性，大孔，SO 22-C2O42-I-NO2-CrO42-Br-scn-Cl-HC
7、OO-OH-F-CH3COO-离子交换动力学：膜扩散粒子扩散交换反应粒子扩散膜扩散吸附状态：牢固吸附、有限吸附平衡、完全解吸。转变条件：pH，离子强度离子交换柱层析的洗脱方式：恒溶剂洗脱：采用固定 pH 及离子强度的洗脱方法；梯度洗脱：采用连续改变 pH、离子强度的洗脱方法（梯度类型包括 pH、离子强度、pH 与离子强度）阶段洗脱：采用相继改变 pH、离子强度的洗脱方法阴离子 pH 从高到低e.g.阳离子 B+吸附在柱上，洗脱可采用不同的缓冲液，开始时采用氢离子浓度较低的缓冲液，然后在该缓冲液中逐渐增加氢离子浓度以取代吸附在柱上的 B+离子；或在同一种 pH值的缓冲液中增加离子强度；或在相同
8、pH 值和离子强度的缓冲液中加入一种比离子交换层析介质亲和力更强的阳离子来取代吸附在柱上的 B+离子。对于具有兼性离子的生物大分子，要对溶液的 pH 值，生物大分子的等电点和离子交换层析介质三种情况同时进行考虑。介质选择：缓冲液的 pH 值高于样品等电点，选择阴离子交换介质，蛋白质向阳极跑反向层析 RPC：是利用被分离样品中不同生物分子表面的极性差别，而将其分离纯化的一种层析技术。反相层析的固定相是非极性的，流动相继续大，非极性样品亲和力大用有机溶剂，极性小，则非极性样品亲和力小，先出来特点：高效，一般用于分离小分子极性大的物质金属螯合层析 MCC 或 IMAC金属螯合层析是利用不同蛋白质分子
9、表面所含组氨酸的差别而将其分离纯化的一种层析技术。特点：对分离对象具有一定的专一性，有选择的吸附某些含有表露的组氨酸、半胱氨酸、咪唑基等生物大分子，配基简单，吸附量大，分离条件温和，通用性强，再生后配体完全恢复，价格便宜金属螯合层析的介质通常是在惰性支持物上接有固定化的金属离子，组氨酸与金属离子具有螯合作用，对于具有不同组氨酸含量的不同蛋白质分子对于一定金属离子的亲和力大小不同 ，因而可通过柱层析进行分离。金属螯合剂：在 sepharos 上接有亚氨基二乙酸（IDE） ，将氯化锌或硫酸铜等溶液通过该柱时即可制备出锌或铜等金属螯合剂。平衡缓冲液：中性； 洗脱缓冲液：偏酸性影响吸附的因素：与金属离
10、子的性质有关（Cu2+ 、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+ ）与样品的性质有关（His 含量不同，His 分布位置不同，Buffer 的 pH 及离子强度）疏水层析（HIC）：是利用被分离样品中不同生物分子表面的疏水性差别，而将其分离纯化的一种层析技术。疏水层析的介质通常是一类在惰性支持物上接有疏水基团的层析载体，如苯基琼脂糖（Phenyl Sepharose）,辛基（Octyl ）,丁基 （ Butyl ）琼脂糖等。特点：利用样品和介质疏水性大小进行分离，样品不必脱盐疏水作用：对于不同的蛋白质和多肽而言，其分子表面一般有着不同的疏水和亲水区结构域，当将这些生物样品加入到含有高盐（高离子
11、）浓度缓冲液的 HIC 柱中时，由于溶液中高浓度盐离子与水分子的作用，降低了样品分子的溶剂化作用，从而增加暴露了样品分子表面的的疏水区，这样就促使样品分子表面疏水基团与 HIC 柱上的疏水基团相互作用结果使样品被吸附到 HIC 柱上。因此疏水层析亦称为疏水相互作用层析。样品的吸附：样品吸附在 HIC 柱上的强弱程度取决于样品本身的疏水性质和样品环境中盐离子的强度。一般来说疏水性强的只需要较低的盐浓度，疏水性弱的则需要较高的盐浓度（如 1.7M (NH4)2SO4 ）样品的解吸：吸附在 HIC 柱上的生物分子，可以采用降低洗脱缓冲液中盐浓度的方法，使其从柱上洗脱下来，洗脱方法可以是梯度也可以是阶
12、段洗脱的方式。样品中不同分子被洗脱的顺序依据其疏水性的弱与强从先到后，从而达到分离的目的洗脱条件：改变离子的组成成分以增强紊乱倾向的能力；降低离子强度；洗脱液中加入去污剂或降低极性的试剂（乙二醇） ；改变 pH 或温度。Elisa 酶联免疫吸附测定：是将固相载体吸附技术和免疫酶测定技术相结合起来的一类分析方法。特点：特异性高，灵敏度高，接近或相当于放射免疫测定的水平（ug 、ng 级） 、操作简便。间接法：检测抗原或抗体。一抗：相应抗原的专一性抗体；二抗：抗免疫球蛋白 Ig 的酶标抗体双抗体夹心法：检测抗原。一抗：相应抗原的专一性抗体；二抗：与一抗相同的酶标抗体固相抗体竞争法：测定抗原印迹法：
13、把从电泳后支持介质上被分离的蛋白质或 DNA 转移到另一种固定介质上的过程称为印迹或转移。在膜上可进行专一或非专一方法检测，eg 酶联同位素免疫测定，同工酶专一染色、考染特点： 一旦转移到固定基质上，蛋白质分子比在凝胶中容易接近探针，而且所有被转移的蛋白质分子都有相同的机会与探针接触（个别例外） 移到固定基质上的蛋白质在探测过程中不会因扩散而失去分辨率 蛋白质转移到膜上后能进行多种分析，因而能得到多份结果 印迹方法只需很少的试剂，处理时间相对较短，且固定化膜容易操作和保存蛋白质印迹方法是高分辨率电泳和灵敏、专一的免疫探测技术的结合点印迹 扩散印迹 溶剂流印迹 电泳印迹将样品直接点到膜上再分析只
14、适合小分子和打孔凝胶适合低分子量和大孔凝胶转移效率高， 用于蛋白质和核酸类样品蛋白质和核酸类 DNA 和 RNA 电泳后的转移重复性好方法简便、快速，但样品未经分离方法简便，时间长（2-3 天） ，影响分辨率毛细管压印 转移条件易于控制电泳：带电质点在电场作用下的移动，称为电泳电泳的特点： 是能带电的物质，都可以应用某一种电泳技术，分离成不同位置的区带，对区带可进行定性或定量分析； 样品用量极少 设备简单 可在温室进行 操作简便，花时间不长 不同类型的区带电泳，有不同的用途 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大提高分辨率影响电位的因素：吸附作用；离子交换作用；压缩作用电泳速度影响因素： 电场
15、强度：电场越强，速度越快 环境：电解质浓度，离子强度（迁移率与离子强度额平方根成反比）、pH（溶液 pH 与蛋白质的 pI 越远，蛋白质带电性越强，速度越快）、电渗、粘度、温度（迁移率）， 样品本身迁移速度：缓冲液浓度大，迁移率小电泳迁移率：在单位电场下，带电质点的移动速度。与球形分子，介质粘度，颗粒所带电荷有关，在确定的条件下，某物质的迁移率为常数。相对迁移率：蛋白质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比蛋白：western blotting（单向电泳后转移） eastern blotting（双向电泳后转移）核酸：southern blotting （DNA 印迹） Northern bl
16、otting（RNA 印迹）毛细管电泳 CE：原理：CE 以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间电泳迁移率 (淌度)和分配行为上的差异而实现分离的一类液相电泳分离技术。特点：三高二少一广高灵敏度，常用紫外检测器的检测限可达 10-13 一 l0-15mol，激光诱导荧 光检测器则达10-19 一 10-21mol;高分辨率，其每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至千万，而 HPLC 一般为几千到几万；高速度，最快可在 60s 内完成有 250s 内分离 10 种蛋白质、1.7min 分离 19 种阳离子及3min 内分离 30 种阴离子的报道；样品少，只需 nL(10
17、-9L)级的进样量;成本低，只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。应用范围广：除分离生物大分子(肽、蛋白质、DNA 和糖等)外，还可用于小分子(氨基酸、药物等)及离子(无机及有机离子等)，甚至可分离各种颗粒(如硅胶颗粒等) 。由于以上优点以及分离生物大分子的能力，使 CE 成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。琼脂凝胶免疫电泳 GIE：是指利用琼脂作为支持介质的区带电泳，结合免疫扩散以提高对免疫组分分辨率的一种免疫化学方法，可鉴定抗原或抗体的纯度和特异性。沉淀反应：原理：分子间引力、库仑力、氢键结合力、疏水作用反应的特性：特异性、多样性、等价性影响因素：电解质、pH、温度对流免疫电泳：
18、条件 pH8.4定量免疫电泳：要求电泳时抗原移动，抗体不动，pH8.6，依据为抗原浓度=抗体浓度使抗原移动抗体不动的方法：控制 pH8.6，采用氨基甲酰化处理，对于抗原是免疫球蛋白类的氨基甲酰化处理，对于抗体的甲酰化处理影响因素：畸形峰；回波效应；电泳时间；抗原、抗体浓度；Buffer 的 pH、离子强度琼脂糖凝胶潜水电泳 SE：原理：分子筛效应特点：易操作和制备，回收率高，可用碱变性条件，样品量可少于 10mg天然琼脂糖凝胶网孔大，DNA 能分离开，有电荷效应，但电泳电压低凝胶的浓度越低，适用于分离越大的 DNA。EB 分子带正电荷，影响核酸分子的带电性，同时它的嵌入增加了核酸分子的刚性而影
19、响其迁移率，EB 分子本身向负极移动影响核酸条带的染色效果，故在测定核酸分子大小和测定核酸含量时不宜将 EB 直接加入凝胶总，可电泳后进行染色聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是一种利用人工合成的凝胶作支持介质的区带电泳方法。Acr+Bis（催化剂） PAG原理：不连续体系（pH、胶浓度、缓冲液成分、电位梯度） ；三大效应（浓缩效应、分子筛效应、电荷效应） （电阻效应，分子量大，浓度低）PAGE 的特点： 品不易扩散； 随意控制凝胶浓度，按照需要制成不同孔径的凝胶； 分子筛效应和电荷效应结合在同一个方法中，使比任何一种单一效应达到更高的分辨能力； 是由-C-C-C-结合的一种酰胺多聚物，侧链上具有
20、不活泼的酰胺基，没有带电的其他离子基，所以电泳时不产生电渗，化学上惰性； 要合成用的原理（单体）纯净，制成的多聚物的再现性高，因此对样品分离的重复性也比较高 一定浓度范围内是透明的，机械强度好，有弹性； 能按照需要把带有一定电荷的基团作为共聚体掺入其中； 需要样品量少，1-100ug 已足够 需要设备简单，时间短 用途广泛，对蛋白质、核酸等生物高分子可进行分离、定性、定量、小量制备、分子量鉴定等AP-TEMED 化学聚合；核黄素-TEMED 光学聚合SDS-PAGE：测定的是蛋白质亚基的分子量影响因素：SDS 的结合程度，样品本身的荷电性质，蛋白质分子量和分子大小特点：电泳过程中具有浓缩效应；
21、增加分子筛效应提高分辨率；可测得天然蛋白质的分子量（适用于球蛋白）SDS 样品处理：SDS-变性剂、助溶剂，可消除蛋白所带电荷的影响，是蛋白都带负电荷，还可以是蛋白的形状发生改变，变为椭圆形等长的蛋白；DTT 使蛋白二硫键断开；加热 100 度 5min，是让蛋白质变性等电聚焦 IEF： 是根据蛋白质等电点的不同而进行分离的一项电泳方法，其分离过程采用了等电平衡技术特点：应用于两性化合物的分离（pHpI 净电荷为负）分辨率高电泳过程中具有浓缩作用加样方法灵活固相 pH 梯度与载体两性电解质 oH 梯度的区别在于前者的介质不是两性分子，在凝胶聚合时便形成 pH 梯度，后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等电点才形成 pH 梯度IPGIEF 的特点：分辨率高；pH 梯度稳定；受盐的影响小；碱性蛋白质能得到很好的分离；加样量大，适合于制备；适合用于双向电泳双向电泳:第一向 IEF；第二向：PAGE 、SDS-PAGE 、免疫电泳
