1、内蒙古师范大学 2013/5/201菠菜色素的提取与分离Extrction ssand isolation of pigments from spinach 余正波内蒙古师范大学 生命科学与技术学院 呼和浩特 010020摘要：本实验用研钵和体积比为 7:3 石油醚-乙醇提取色素，使用硅胶柱层析法对叶绿素、胡萝卜素和叶黄素进行分离，以此了解天然物质分离提纯方法，了解柱层析的基本原理，掌握柱层析的操作技术。关键词：菠菜色素 石油醚-乙醇 分离 硅胶柱层析菠菜中含有胡萝卜素、叶黄素和叶绿素等色素。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂，主要以叶绿 a 和叶绿素 b 两种形式存在。胡萝卜素具有三种异
2、构体，其中 - 胡萝卜素除具有维生素 A 的生理活性，作为维生素 A 使用外，还能清除体内自由基，提高人体免疫力，延缓细胞和机体衰老。叶黄素是一种类胡萝卜素，是天然的食品色素和食品营养剂，具有明显的抗氧化、抗衰老和抗突变等生物活性,此次实验采用硅胶柱层析对色素进行分离纯化。1 实验部分1.1 实验目的 通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；了解柱层析的基本原理，掌握柱层析的操作技术。1.2 实验原理 通过柱色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿） 、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。 叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素
3、 a(C55 H72O5N4Mg) 和叶绿素 b(C 55H7O6N4Mg) ，其差别仅是 a 中一个甲基被 b 中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素 a 的含量通常是 b 的 3 倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。 胡萝卜素（ C40H56 ）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即 a-, - 和 - 胡萝卜素，其中 - 异构体含量最多，也最重要。在生物体内， - 体受酶催化氧化即形成维生素 A。目前 - 胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素 A 使用，也可作为食
4、品工业中的色素。 叶黄素（ C40H56O2 ）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。 内蒙古师范大学 2013/5/2021.3 主要仪器与试剂 研钵、离心机、三角瓶、试管、层析柱，抽滤瓶，烧杯，铁架台；硅胶，乙醇，丁醇, 石油醚（6090） ，丙酮，菠菜叶。1.4 实验流程 菠菜-研磨离心-菠菜汁- 石油醚乙醇萃取-萃取液-纯水洗涤、无水硫酸钠干燥-石油醚浸膏 -柱层析- 色带 -洗脱-色素回收1.5 操作步骤 1.5.1 菠菜色素的提取 称取 2g 洗净后的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎后放入研钵，充分研磨后加入约
5、 15mL 7:3（体积比）的石油醚 /乙醇混合液，搅拌继续研磨约 2min，然后用离心机离心分离（3500rpm，5min）菠菜汁，弃去滤渣。将滤液转入分液漏斗，加入 30mL 水萃取洗涤（分两次，每次 15mL） ，以彻底除去萃取液中的乙醇。洗涤时要轻轻旋荡，防止产生乳化。处于上层的石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入试管。1.5.2 装柱 取一支洁净干燥的层析柱，从柱口小心装入活性硅胶（160-200 目，于100-110 活化 2 小时） ，边装边轻轻敲打层析柱，使填装紧密均匀，直至硅胶粉柱高达 8 厘米时为止。然后在柱顶再加上一层 0.5cm 高的海沙。将此层析柱固定在铁架台上。1.5.3
6、 柱平衡打开层析柱下端活塞，用小烧杯从柱口沿管壁小心加入石油醚流出（切勿把硅胶表面冲乱） 。当柱顶尚留有少量石油醚时，关闭下阀，停止流出（使用前回收瓶应该干燥，这样回收的石油醚倒出后，可以用于配制洗脱液） 。1.5.4 加样预先准备好的提取液 0.5ml，小心加入层析柱上端（用胶头滴管加入） ，打开下阀，待提取液完全进入层析柱之后关闭下阀。1.5.5 洗脱待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂石油醚/丙酮溶液 8:2 （体积比） 。打开活塞，让洗脱剂逐滴流出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。用石油醚-丙酮 5:5 （体
7、积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素。再用丁醇/乙醇/水 3:1:1 （体积比）洗脱叶绿素 a （蓝绿色）和叶绿素 b （黄绿色） 。1.6 注意事项 层析柱装填紧密与否, 对分离效果影响很大。若柱中留有气泡或各部分松紧不匀（更不能有断层）时，会影响渗透速度和显色的均匀。在吸附柱上端要加入少量海沙，以防止加样品和洗脱剂时将吸附剂冲起，影响分离效果。内蒙古师范大学 2013/5/203为了保持吸附柱的均一性，应该使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中，即从第一次注入石油醚起直至实验完毕，绝不能让柱内液体的液面降至沙层之下。否则当柱中溶剂或溶液流干时，会使柱身干裂。若再重新加入溶剂，会使吸附柱的各
8、部分不均匀而影响分离效果。2.结果与分析2.1 实验结果胡萝卜素在层析柱中首先分离得到，叶黄素次之，叶绿素最后得到。并且提取的胡萝卜素为橙黄色，叶黄素为黄色，叶绿素 a 为蓝绿色，叶绿素 b 为黄绿色。2.2 实验分析结果表明，采用果胶柱层析法分离植物色素与真实结果极为接近，并且操作简单。因此，其有利于学生掌握该柱层析的操作技术，也有助于加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理和更深刻了解天然生物色素的提纯方法。吸附色谱法是混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。溶剂流经吸附剂时发生无数次吸附和脱附的过程，吸附强的组分移动得慢留在柱的上端，吸附弱的组分移
9、动得快在柱的下端，从而达到分离的目的。柱色谱流动相叫洗脱剂，其极性的大小直接影响实验的效果。极性大的洗脱剂洗脱能力大，因此可先用极性小的洗脱液，将吸附能力弱的组分洗脱下来，然后换用极性大的洗脱剂，将吸附能力强的组分从吸附柱中洗出。由于化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强。因此，在洗脱过程中极性小的组分先被洗出.所以菠菜中色素的极性为胡萝卜素 叶黄素 叶绿素 a叶绿素 b，即胡萝卜素首先被洗脱下来。图 1 色素在层析柱中分离的过程截图1胡萝卜素2叶黄素3叶绿素 a4叶绿素 b1 2 3 4图 2 色素分离结果内蒙古师范大学 2013/5/204参考文献
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11、出版社,2001.Extrction ssand isolation of pigments from spinachAbstract: The experiment with a mortar and the volume ratio of 7:3 petroleum ether and ethanol extraction of pigments, the use of silica gel column chromatography on chlorophyll, carotene and lutein were isolated, in order to understand the separation and purification methods of natural substances, to understand the basic principles of column chromatography, operation skills column chromatography.Key words: spinachrome the petroleum ether and ethanol separate Silica gel column chromatography
