GB5009.30 - 食品中叔丁基羟基茴香醚（BHA)与2，6-二叔丁基对加酚（BHT）的测定.docx

1、 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB 5009.30xxxx2010-发布 1.1.1.1 2010-06-01 实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布xxxx-xx-xx 发布 xxxx-xx-xx 实施食品安全国家标准食品中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的测定（征求意见稿）GB 5009.30xxxxI前 言本标准代替 GB/T 5009.30-2003食品中叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的测定 。本标准与 GB/T 5009.30-2003 相比主要变化如

2、下：气相色谱法增加毛细管柱分析测定条件；删除了填充柱分析测定条件，更改了样品提取方式；增加液相色谱法；修改了计算公式；删除 GB/T 5009.97-2003食品中环己基氨基磺酸钠的测定中的第二法薄层色谱法和第三法比色法；依据 GB/T1.1-2009标准化工作导则第一部分：标准结构与编写规则和 GB/T 20001.4-2001标准编写与规则 第四部分：化学分析方法对原标准的结构进行了修改。GB 5009.30xxxx1食品安全国家标准食 品 中 叔 丁 基 羟 基 茴 香 醚 （ BHA） 与 2， 6-二 叔 丁 基 对 甲 酚 （ BHT） 的测定1 范围本标准规定了植物油、奶油、糕点

3、等食品中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）的二种测定方法气相色谱法、液相色谱法。本标准气相色谱法适用于植物油、奶油、糕点等食品中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）的测定。本标准液相色谱法适用于植物油、奶油、糕点等食品中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）的测定。第一法 气相色谱法2 原理试样中的叔丁基羟基茴香醚（BHA）和 2,6二叔丁基对甲酚（BHT）用甲醇提取，经气相色谱分离后用氢火焰离子化检测器检测，根据试样峰面积（或峰高）与标准峰面积（或峰高）比较定量。3 试剂和材料3.1. 试剂3.1.1. 甲醇

4、 (CH3OH)：色谱纯3.1.2. 石油醚：沸程为 30 60 。3.2. 标准品3.2.1. 叔丁基羟基茴香醚（BHA）（C 11H16O2），纯度 98.0%。3.2.2. 2，6-二叔丁基对甲酚 （BHT）（C 15H24O），纯度99.0%。3.3. 标准溶液配制3.3.1. 叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）标准贮备液（2.00 mg /mL）：分别称取 0.1000 g 叔丁基羟基茴香醚（BHA ）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）标准物质于 50.0 mL 容量瓶中 ，用甲醇溶解并定容至刻度，置于 1 -4 冰箱保存，可保存 1 个星期。3.3

5、.2. 叔丁基羟基茴香醚（BHA ）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）中间液（200 g /mL）：分别吸取 1.0 mL 叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）标准贮备液（3.3.1）于 10 .0 mL 容量瓶中，用甲醇溶液定容刻度，临用时配制。3.3.3. 标准曲线工作液：分别吸取叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）中间液（3.3.2）0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL 于 10.0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容。此即为 2.0 g/mL、4.0 g/mL、10 g/mL、20

6、 g/mL、40 g/mL、100 g/mL 的标准工作液的浓度，临用时配制。GB 5009.30xxxx24 仪器与设备4.1 气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器（FID）。4.2 天平：感量为 0.0001 g 及 0.001 g。4.3 涡旋振荡器。4.4 离心机：转速3000 r/min。4.5 样品均质器。4.6 旋转蒸发仪。4.7 恒温水浴锅5 分析步骤5.1 试样制备5.1.1. 植物油（花生油、豆油、菜籽油、芝麻油）称取 5.000 g 植物油置 25 mL 具塞离心管中，加入 13.0 mL 甲醇（3.1.1） ，涡旋（2200 r/min） 3 min，放置 2 min，离

7、心（3000 r/min3500 r/min）10 min，吸取上清液于 100 mL 浓缩瓶中，重复提取 2 次，合并甲醇提取液。于 40水浴中减压浓缩约至 5 mL，用甲醇转移并定容至 10 mL 比色管中，混匀。于-20冰箱中冷冻 1 小时，待溶液澄清后过有机滤膜，滤液留作气相色谱用。5.1.2. 黄油等固体油脂称取 5.000 g 黄油等固体油脂置 25 mL 具塞离心管中，加入 13.0 mL 甲醇（3.1.1） ，置于 60水浴中，待固体油脂完全熔化后取出，趁热涡旋（2200 r/min） 3 min, 放冷水中冷却，离心（30003500 r/min）10 min，吸取上清液置

8、100 mL 浓缩瓶中，重复提取 2 次，合并甲醇提取液。于40水浴中减压浓缩约至 5 mL，用甲醇溶液转移并定容至 10 mL 比色管中，于-20 冰箱中冷冻 1 小时，待溶液澄清，留作气相色谱用。5.1.3. 食品（油炸花生米、糕点、饼干）根据食品中含油脂程度的多少，适量称取 50 300 g，混合均匀，置于 500 mL 具塞锥形瓶中，加入适量的石油醚（3.1.2） ，放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，称取残留脂肪 5.000 g 置100 mL 具塞离心管中，加入 13.0 mL 甲醇（3.1.1） ，涡旋（2200 r/min） 3 min，放置 2 min，离心（30003

9、500 r/min）10 min，吸取上层清液置 100 mL 浓缩瓶中，重复提取 2 次，合并甲醇提取液。于 40水浴中减压浓缩约至 5 mL，用甲醇溶液转移并定容至 10 mL 比色管中，于-20 冰箱中冷冻 1小时，待溶液澄清，留作气相色谱用。5.2 仪器参考条件a) 色谱柱 : 毛细管柱： (14%-氰丙基- 苯基)甲基聚硅氧烷， 30 m0.25 mm0.25 m）或等效柱。b) 柱温升温程序：初温 80 保持 1 min，10 /min 升温至 250 保持 15 min。c) 进样口：温度 230 ；进样量 1 L，分流进样，分流比 12(分流不分流可根据色谱条件调整） 。d)

10、检测器：氢火焰离子化检测器（FID） ，温度 260 。e) 载气：高纯氮气，流量 1.0 mL/min，尾吹 30 mL/min。f) 氢气：40 mL/min ；空气 450 mL/min（载气、氢气、空气流量大小可据仪器条件进行调整） 。5.3 标准曲线的制作GB 5009.30xxxx3将标准系列工作液分别注入气相色谱仪中，测定相应的不同浓度标准的峰面积响应值，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，绘制标准曲线。5.4 试样溶液的测定将试样溶液注入气相色谱仪中，得到相应的峰面积响应值，根据标准曲线得到待测液中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的

11、浓度，平行测定次数不少于两次。6 分析结果的表述试样中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（ BHT）含量按公式（1）计算：（1）01mVCXi式中：Xi试样中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的含量，单位为克每千克（g/kg） ；C由标准曲线计算出进样液中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）m试样中称取的油脂质量 ，单位为克（g） 。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留 3 位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术

12、平均值的 10%。8 其它标准浓度的线性范围 2.0 g/mL200 g/mL ；当试样量为 5 g、定容体积为 10.0 mL 时，叔丁基羟基茴香醚（BHA）方法定量限 (LOQ)2.0 mg/kg; 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）方法定量限(LOQ)4.0 mg/kg。第二法 高效液相色谱法9 原理试样中的叔丁基羟基茴香醚（BHA）和 2,6二叔丁基对甲酚（BHT）用甲醇提取，经液相色谱分离后用紫外吸收检测器或二极管阵列检测器检测，根据试样峰面积（或峰高）与标准峰面积（或峰高）比较定量。10 试剂和材料注 1：除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T6682 规定的二级水。10

13、.1. 试剂10.1.1 甲醇 (CH3OH)：色谱纯10.1.2 乙酸（CH3COOH）：分析纯10.1.3 石油醚：沸程为 30 60 GB 5009.30xxxx410.2. 叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（ BHT）标准品10.2.1 叔丁基羟基茴香醚（C11H16O2） ，纯度98.0%。10.2.2 2，6-二叔丁基对甲酚（ C15H24O） ，纯度99.0% 。10.3. 叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（ BHT）标准溶液配制10.3.1 叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）标准贮备液（2.00 mg /mL

14、）：分别称取 0.1000 g 叔丁基羟基茴香醚（BHA ）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）标准物质于 50.0 mL 容量瓶中 ，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀。置于 1-4冰箱保存，可保存 1 个星期。10.3.2 叔丁基羟基茴香醚（BHA ）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）中间液（200 g /mL）：分别吸取 1.0 mL 叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）标准贮备液于 10 .0 mL 容量瓶中，用甲醇溶液定容刻度，临用时配制。10.3.3 标准曲线工作液：分别吸取叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）中间液（10.3.

15、2）0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL 于 10.0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容。此即为 2.0 g/mL、4.0 g/mL、10 g/mL、20 g/mL、40 g/mL、100 g/mL 的标准工作液的浓度，临用时配制。11 仪器与设备11.1 液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。11.2 天平：感量为 0.0001 g。11.3 涡旋振荡器。11.4 离心机：转速4000 r/min。11.6 旋转蒸发仪。11.7 恒温水浴锅12 分析步骤12.1 试样制备12.1.1 植物油（花生油、豆油、菜籽油、芝麻油）称取 5.

16、000 g 植物油置 25 mL 具塞离心管中，加入 13.0 mL 甲醇（3.1.1） ，涡旋（2200 r/min） 3 min，放置 2 min，离心（3000 r/min3500 r/min）10 min，吸取上清液于 100 mL 浓缩瓶中，重复提取 2 次，合并甲醇提取液。于 40水浴中减压浓缩约至 5 mL，用甲醇转移并定容至 10 mL 比色管中，混匀。于-20冰箱中冷冻 1 小时，待溶液澄清后过有机滤膜，滤液留作液相色谱用。12.1.2 黄油等固体油脂称取 5.000 g 黄油等固体油脂置 25 mL 具塞离心管中，加入 13.0 mL 甲醇（3.1.1） ，置于 60水浴中

17、，待固体油脂完全熔化后取出，趁热涡旋（2200 r/min） 3 min, 放冷水中冷却，离心（3000 r/min 3500r/min）10 min，吸取上清液置 100 mL 浓缩瓶中，重复提取 2 次，合并甲醇提取液。于40水浴中减压浓缩约至 5 mL，用甲醇溶液转移并定容至 10 mL 比色管中，于-20 冰箱中冷冻 1 小时，待溶液澄清后过有机滤膜，滤液留作液相色谱用。12.1.3. 食品（油炸花生米、糕点、饼干）根据食品中含油脂程度的多少，适量称取 50 g 300 g，混合均匀，置于 500 mL 具塞锥形瓶中，GB 5009.30xxxx5加入适量的石油醚（3.1.2） ，放置

18、过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，称取残留脂肪 5.0 g（精确到 0.001 g）置 50 mL 具塞离心管中，加入 13.0 mL 甲醇（3.1.1） ，涡旋（2200 r/min） 3 min，放置 2 min，离心（3000 r/min3500 r/min）5 min，吸取上层清液置 100 mL 浓缩瓶中，重复提取 2 次，合并甲醇提取液。于 40水浴中减压浓缩约至 5 mL，用甲醇溶液转移并定容至 10 mL 比色管中，于-20冰箱中冷冻 1 小时，待溶液澄清后过有机滤膜，滤液留作液相色谱用。12.2 仪器参考条件色谱参考条件色谱柱： ODSC18柱，5 m ，250 mm4.

19、6 mm,或同等性能的色谱柱。流动相A： 1 %乙酸水溶液；流动相B : 甲醇，梯度见表1表1 洗脱梯度时间，min 流动相 A,% 流动相 B， % 流量，mL/min60 40 1.04 40 60 1.08 20 80 1.013 10 90 1.018 10 90 1.021 0 100 1.026 0 100 1.030 60 40 1.035 60 40 1.0进样量：20 L。柱温：25 。检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器。检测波长：280 nm。12.3 标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的不同浓度标准的峰面积响应值，以标准工作液的浓度为横坐标，以

20、峰面积响应值为纵坐标，绘制标准曲线。12.4 样品的测定将试样溶液注入液相色谱仪中，得到相应的峰面积响应值，根据标准曲线得到待测液中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的浓度，平行测定次数不少于两次。13 分析结果的表述试样中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与2，6-二叔丁基对甲酚（ BHT）含量按公式（2）计算：（2）10mVCXi式中：Xi试样中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的含量，单位为克每千克（g/kg） ；C由标准曲线计算出进样液中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）GB 50

21、09.30xxxx6m油脂质量 ,单位为克（g） 。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。14 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15 其它标准浓度的线性范围2.0 g/mL200 g/mL ；当试样量为5 g、定容体积为10.0 mL时，叔丁基羟基茴香醚（BHA）方法定量限(LOQ)2.0 mg/kg; 2，6- 二叔丁基对甲酚（BHT）方法定量限(LOQ)2.0 mg/kg。GB 5009.30xxxx7附录 A叔丁基羟基茴香醚（BHA ）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（ BHT）色谱图图 A.1 为

22、叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的气相色谱图min12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.pA1802020240260280FID1 A, (2010826.320BIAO.D)14.215 - BHT15.296 - BHA图 A.1 叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）图 A.2 为叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的质控样的气相色谱图min12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.pA1802020240260280FID1 A, (2010826.312.D

23、)14.216 - BHT 15.29 - BHA图 A.2 叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的质控样的气相色谱图GB 5009.30xxxx8图 A.3 为叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）标准液相色谱图图 3 叔丁基羟基茴香醚（BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（ BHT）液相色谱图图 A.4 为检出叔丁基羟基茴香醚（ BHA）与 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的试样的液相色谱图图 4 检出叔丁基羟基茴香醚（BHA ）与 2，6- 二叔丁基对甲酚（ BHT）的试样的液相色谱图GB 5009.30xxxx9食品安全国家标准 食品

24、中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）测定编制说明一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等）标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。主要起草人：杨大进、杨杰、方从容简要起草过程： 2010 年 11 月份底完成资料收集、整理工作，并公开征求多方对标准修订的意见，以确定研究方法与技术路线增加分离度高的毛细管气相色谱法，高效液相法，针对方法重现性、灵敏度、检出限、分离度、准确度、线性关系等技术内容的确定研究。2011 年 5 月底完成检验方法的实验摸索研究，起草出方法初稿。2011 年 6 月底完成检验方法标准验证工作，公开征求各方

25、对标准（草案）意见。2011 年 8 月按照协议要求完成卫生标准（修）订工作，按期提交送审稿。二、标准的重要内容及主要修改情况1 删除薄层色谱法和比色法：GB/T5009.30-2003 中薄层色谱法是定性和半定量方法，测定过程需要自制硅胶板、聚酰胺板，消耗多种有机试剂，操作繁琐复杂其灵敏度较低，重现性较差，已不再适应现代检验分析的要求。遂决定删除。GB/T5009.30-2003 中比色法测定试样中 BHT 的含量， 运用了甘油浴和蒸馏等复杂操作，又因该检测结果是针对于样品中 BHT 的含量，而不是针对油脂中 BHT 的含量，与 GB2760-2011 中限量标准不符，方法存在表述不清、操作

26、可行性差、灵敏度和重现性差等缺点，遂决定删除。2 气相色谱法的修订：GB/T 5009.30-2003 中气相色谱法是结合 AOAC 分别于 1965 年和 1968 年提出的食品中抗氧化剂的定性显色实验和气相色谱法进行修订的。该方法是采用石油醚溶解样品，过层析柱净化，用二氯甲烷洗脱，减压浓缩后用二硫化碳定容，进行气相色谱分析整个检测步骤繁琐，复杂，工作量大，并且采用大量有毒的有机试剂。其中气相色谱柱仍然沿用玻璃填充柱。遂决定根据现有标准和文献对气相方法进行更改。更改后的方法为直接采用甲醇对油脂进行溶解萃取，在拟定的测定参数下直接进样分离其中的 BHA、BHT,。2.1 气相色谱法的溶剂提取通

27、过实验摸索，采用甲醇作为提取溶剂。2.2 气相色谱法的仪器测定条件原国标方法采用填充柱分离，分离效果差、准确性差、灵敏度低，对含量较低的样品不能满足需要。拟修订为毛细管柱进行分离，并对毛细管柱分析条件进行了优化。选用同样柱长 30 m、同样内径0.25 mm、膜厚 0.25 m 的（14% 氰丙基苯基）二甲基聚硅氧烷毛细管柱。2.3 方法的科学性、可操作性的验证2.3.1 线性范围：标准溶液在 2.0 g/mL200 g/mL，线性良好，线性回归方程为： BHA Y=2.943X -0.111；r=0.9999；BHT Y=3.53 X-0.0.297；r=0.9999。2.3.2 定量限：选

28、取不含对 BHA、BHT 的某花生油样品 6 份、称样量为 5.0 g,分别加入BHA、BHT 低标溶液，按标准方法进行处理，定容体积为 10.0 mL。得到油脂中 BHA 定量限为 2 mg/kg，BHT 定量限为 4 mg/kg。2.2.3 方法准确度和精密度：对油脂样品进行三个浓度(4 mg/kg，20 mg/kg ，200 mg/kg ）加标回收率试验，结果显示 2 种抗氧化剂的回收率在 82.5100.0% 之间，表明方法准确度良好。GB 5009.30xxxx10选择空白的油脂样品进行 20 mg/kg 浓度的加标精密度试验，平行做 6 个样品，结果显示相对标准偏差（RSD ）为

29、1.103.62%。精密度良好。3 增加液相色谱法AOAC 于 1983 年就颁布了检测 PG、TBHQ 、BHA 、BHT 的高效液相色谱方法（983.15） 。我编制组在参考了国内外文献、AOAC 方法、国标、行业标准中抗氧化剂（PG、TBHQ 、BHA、BHT）检测方法的基础上，建立起精密度、准确性高的油脂中抗氧化剂（PG、TBHQ、BHA、BHT）的液相色谱方法。3.1 色谱分离条件的优化选择：分别进行了以下几个方面的工作：方法的比较色谱条件的选择前处理方法的优化等工作，最终确立了以甲醇为提取溶剂；色谱条件如下：色谱柱：Diamonsil（钻石） C18 （4.6 mm250 mm 5

30、m） ；柱温：25；流动相 A：1%乙酸溶液；流动相 B：甲醇，梯度洗脱；流速：1.0mL/min； 检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器；检测波长：280 nm；进样量：20 L。在此色谱条件下，色谱峰峰形对称，分离度较好。 PG -8.24TBHQ -9.815BHA -13.062 BHT -20.5AU050.1.50.2.5 分2.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.0图1 PG、TBHQ、BHA、BHT标准分离色谱图TBHQ -9.86 BHT -20.584AU0.2.406.810.24.1608 分2.04.06.08.010.12.014.0

31、16.018.020.2.0图2 某样品分离谱图3.2 方法的科学性、可操作性的验证3.2.1 检验方法的定量限选取不含 PG、TBHQ、BHA、BH 的某花生油样品，根据四种抗氧化剂加标回收结果，油脂中pG、TBHQ、BHA、BHT 的定量限定为 2 mg/kg。3.2.2 检测方法准确度和精密度选择空白的油脂样品进行 20 g/mL 浓度的加标精密度试验，平行做 6 个样品，结果显示相对标准偏差（RSD ）为 4.65%。精密度良好。3.2.3 检测方法的应用采用本方法共对市场采集的 15 份油脂样品进行检测，包括花生油、葵花籽油、食用调和油、黄油GB 5009.30xxxx11等，检测结

32、果最大值、最小值分别为 2.79 g/kg、0.061 g/kg。三、国际国内标准情况日本卫生试验法（1990-1994 年）中食品添加剂试验法中亦规定了食品中 BHA 与 BHT 测定的相关检测方法，方法包括薄层谱法定性和气相色谱法。AOAC 于 1965 年首次提出了食品中抗氧化剂显示定性鉴别方法，方法为制备 Florisil 柱对样品进行净化后，添加适当试剂，定性显色。方法编号为 965.28AOAC 于 1968 年首次提出了 谷类中 BHA 与 BHT 的方法，方法为气相色谱法。方法编号为968.17。AOAC 于 1983 首次提出了油、脂肪和白脱油中抗氧化剂（PG、TBHQ、BHA 、BHT）的液相色谱法测定方法，方法编号为 983.15.，目前暂未列入国家标准分析方法。四、其他需要在网上公开说明的事项无。