1、1,第10章 经典液相色谱法,液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称。,经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀常压下输送流动相柱效较低 分析周期长 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀高压下输送流动相柱效较高分析周期短,2,第1节 液-固吸附柱色谱,（一）分离原理 （二）常用吸附剂 （三）色谱条件的选择,3,各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心， 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附 能力差异而实现分离,固定相为固体吸附剂，属吸附色谱,（一）分离原理,4,（二）、吸附剂,对吸附剂的要求： （1）具有较大的表面积和一定的吸附能力 （2）颗粒要有一定的细度(d=75-150m，即 100-20
2、0目)，且粒度均匀 （3）与洗脱剂及样品不起反应,常用：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔树脂,5,吸附机制： 表面的硅醇基，与物质形成氢键,适用范围：微酸性（pH=45），适于酸性和中性物质,失活：水与硅醇基结合使其失去活性,活化：105-110加热30min,粒度：100-200目,1. 硅胶（SiO2H2O）中等极性吸附剂,6,碱性氧化铝 pH 910 适于分析碱性、中性物质如：生物碱中性氧化铝 pH 7.5 适于分析酸性碱性和中性物质如：生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸碱中不稳定的苷类、酯、内酯等化合物酸性氧化铝 pH 45 适于分析酸性、中性物质如：酸性色素、氨基酸、对酸稳定的中性物
3、质,2. 氧化铝,7,硅胶、氧化铝的含水量与活性关系,活度测定法：Brockmamn法,8,3、聚酰胺,商品名：锦纶、尼龙-6 不溶于水和有机溶剂，易溶于浓无机酸,分离机制：主要是氢键吸附,适用对象：黄酮类、鞣质、醌,粒度：20100目,氢键能力强 组分越后出柱,9,（三）色谱条件的选择：,1. 被测组分性质（极性大小）： 烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯酮醛胺酰胺醇酚羧酸,依据被测组分、吸附剂和流动相的性质,2. 吸附剂的选择：吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力强强极性物质选择弱吸附剂弱极性物质选择强吸附剂,酸性成分：硅胶 碱性成分：氧化铝 黄酮类：聚酰胺,用量： 化学分离：30倍 除杂：10
4、倍,11,“相似相溶”原则 ：分离极性大的物质应选用极性大的溶剂作流动相，分离极性小的物质应选用极性小的溶剂作流动相，,3、流动相的选择,流动相极性： 烷烃 苯 乙醚 氯仿 酯 酮 醇 水 常用：不同配比的甲醇-水或甲醇亲脂性成分用氯仿、乙酸乙酯,12,4. 三者关系图示：,组分 吸附剂 流动相极性 活性小 极性 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性,物质的极性与双键、极性基团、分子内氢键有关,13,（四）、操作方法,2、上样,3、洗脱,1、色谱柱的制备要求：填装均匀、紧密，不能有气泡。装柱时柱要垂直，表面平整。固定相的用量适宜。柱体：色谱柱、注射器方法：干装法、湿装法,14,第2节 离子交换
5、柱色谱法,1、离子交换树脂： 树脂：母体骨架是苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的球形网状结构的高分子聚合物,-SO3H、-COOH 阳离子交换树脂 钠型 -N(CH3)3+、-NH2 阴离子交换树脂 氯型,交联度：交联剂（如二乙烯苯）的用量 阳离子交换树脂交联度以8， 阴离子交换树脂交联度以4左右为宜。 交换容量 理论交换容量：每克干树脂含有可交换基团的数目 实际交换容量：每克干树脂真正参加交换的基团数目 用酸碱滴定法测定，单位以mmol/g表示。树脂的交换容量一般为110mmol/g。,2、性能,16,再生,RSO3-H+ + Na+ + Cl-,RSO3-Na+ + H+ + Cl-,2、性能,交
6、换,再生,RCH2N(CH3)3+OH- + Na+ +Cl-,CH2N(CH3)3+Cl-+ NaOH,交换,再生,17,3、分离机理：选择系数不同,离子价数越高，原子序数越大，水合离子半径越小和离子交换树脂的亲和力越大，即选择系数越大,4、应用：离子型化合物中药生物碱提取物,18,应用实例,准确称取加正己烷索氏提取10h加样于硅胶柱上(硅胶12g，硅胶柱为由10x250mm的玻璃柱，湿法装柱)。先用约50ml石油醚洗涤，再用石油醚乙醚甲酸(89：11：1) 洗脱，收集,分析化学. 2002，30（8）：901,高效液相色谱法测定银杏外种皮中银杏酸的含量,（一）样品预处理,19,应用实例,（
7、二）化学分离,藏药湿生扁蕾的化学成分研究中国中药杂志 2004，29（11）：1055,20,小结,经典液相柱色谱的主要用途：色谱分析前样品预处理、化学分离熟悉各种柱的使用掌握常用吸附剂的性质掌握色谱条件的选择掌握洗脱规律,21,第3节 平面色谱法,操作形式:平面 流动相：展开剂 操作：点样、展开 驱动力:毛细管力,22,特点：设备简单，分析速度快 应用：中药的定性鉴别,平面色谱法,按固定相类型分类：硅胶、氧化铝 薄层色谱法滤纸 纸色谱法聚酰胺薄膜,23,2、比移值（Rf）,可用范围：0.2-0.8 最佳范围：0.3-0.5,1、原点、溶剂前沿、展距,分离的前提： k不同,平面色谱法,24,1
8、、Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关 2、色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为,讨 论,3. 相对比移值Rs,讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1,26,薄层色谱法,1、定义：将固定相(吸附剂)均匀地铺在具有光洁表面的薄板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法。,薄板：玻璃、塑料薄膜、铝箔 吸附剂：硅胶、氧化铝,一、概述,二、硅胶薄层色谱法,（一）分类：
9、 硅胶H、硅胶G、硅胶HF254、硅胶GF254,G：指含煅石膏(Gypsum)黏合剂 H：不含黏合剂 F254：含一种在254nm下能发出黄绿 色荧光的无机荧光剂 F365：含荧光剂，365nm紫外光照发光,粒度：1040m(250300目）,含荧光剂的硅胶适用于本身不发光又无适当显色剂显色的物质,28,（二）分离机理,1、样品分子与展开剂分子对硅胶表面硅醇基的竞争吸附 2、展开剂对样品分子的溶解,29,（三）操作方法：制板点样展开检视,硅胶薄层色谱法,30,（一）制板,粘合剂：水或CMC-Na，用量1:3,厚度：0.3mm，制备时0.5mm,活化：自然晾干后，105烘1h,贮备：干燥器,3
10、1,（1）样品溶液的制备：一般用低沸点、弱极性、易挥发的有机溶剂。不宜用水。,（2）器具：毛细管、微量注射器,2、点样,（3）点样量：110l,32,（4）点样方法：垂直方向，不能用力太大,（5）点样后溶剂须挥干,点 样,1cm,1cm,点样斑点直径2mm,一般为圆点，或条带状,33,展开槽（层析缸）要求：密封性好,3、展 开,单槽,双槽,34,展距：815cm,1、展开方式,上行法展开、近水平展开方式,对展开剂的基本要求： 不与组分或吸附剂存在化学反应 使样品各组分分离，分离度1.5 使待测组分的Rf在0.30.5 展开后各斑点圆而集中，不拖尾 具有适中的沸点和小的粘度 临用前配制,2、展开
11、剂,36,展开剂的组成：单一溶剂、多元溶剂单一溶剂：重现性好，分离能力差多元展开剂：可改善分离效果，重现性差,展开系统的优化,优化原则：先调整展开剂极性使待测组分Rf值适中，保持这个极性不变，改变展开剂的选择性，直至所有组分有合适的分离度,Stahl图解法,展开系统的优化,Rf值的决定因素：组分极性 展开剂的极性 吸附剂的活性,38, 加入少量的酸碱,常用酸：甲酸、冰醋酸 常用碱：浓氨水、乙二胺,展开系统的优化, 展开剂用量： 展开剂浸没薄板下端约0.5cm,39,常用展开系统 人参皂苷、黄芪甲苷： 氯仿-甲醇-水（65：35：10，下层） 正丁醇-醋酸乙酯-水（4：1：5，上层） 黄酮苷：醋
12、酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1） 糖：正丁醇-冰醋酸-水（4：1：5，上层）,展开系统的优化,中等极性：甲苯-醋酸乙酯-甲酸（10：3：0.5),40,苯醋酸乙酯甲醇异丙醇浓氨水（6：3：1.5：1.5：0.5）,展开系统的优化,41,3、展开过程的控制,（1）展开方式：多次、分步展开,一次展开,多次展开,原因：低极性低沸点物质在薄层板边缘易挥发,产生边缘效应,克服办法：a “预饱和” b 层析缸内壁贴浸湿的滤纸条 c 点样时不要太靠边缘,展开过程的控制,（2）溶剂蒸气的饱和程度,43,（3）湿度,（4）温度,展开过程的控制,44,1、定位方法：日光检视紫外光365nm下检视紫外光2
13、54nm下检视,检 测,荧光淬灭斑点,45,a 喷雾显色 注意：喷雾显色前展开剂须挥干喷雾宜细而均匀,b 浸渍显色 注意： 浸渍液溶剂易挥发，否则斑点扩散浸渍时间为几秒,检 测,2、显色剂：与待测物质反应生成有色化合物,46,1） 加热 加热时应把握好时间和温度，特别在定量时应注意(常510min),2）防止显色后褪色 加热显色后的板盖上一洁净的玻板并封边，放置于干燥器中,注意：,检 测,47,四、高效薄层色谱法（HPTLC）,高效薄层板：粒度510m普通板：1040m 特点：点样量小，展距短，斑点集中，分离度好，灵敏度高,48,五、聚酰胺薄层色谱法,聚酰胺色谱是分离黄酮类是最有效的方法,常用
14、溶剂系统,苷元：氯仿-甲醇（96：6）氯仿-甲醇-甲酸（30：20：1）苷： 甲醇-水（4：1）30%60%醋酸,49,六、纸色谱法,1、载体：纸固定相：纤维素结合的水，属正相分配色谱展开剂：有机溶剂（正丁醇）,2、适用：极性化合物（多糖）,葡萄糖,鼠李糖,毛地黄毒糖,极性,最强,其次,最弱,Rf值,最小,其次,最大,3、Rf值与物质的化学结构的关系：,51,样品预处理,七、薄层色谱法的应用,52,依据：固定色谱条件下，相同物质的Rf值相同,供试品 对照药材 对照品阴性对照,1 2 3 4,（一）定性鉴别,53,1、 限量检查,如：附子中乌头碱的限量检查,1. 乌头碱对照品 2，3，4. 样品,（二）定量分析,2、洗脱测定法,准确吸取直线状点样，置于层析缸中，展至14cm，取出晾干，于紫外灯下，用针将Rf值约为0.4的盐酸吗啉双胍谱带划出，用刮刀将谱带全部刮入100 ml容量瓶中，准确加入50ml蒸馏水，振摇静置离心。准确吸取上清液以蒸馏水作参比，在237nm处测其吸光度,盐酸吗啉双胍分析方法研究,55,3 杂质检查,检查枸橼酸乙胺嗪中的N-甲基哌嗪,1 对照品(50mg/ml) 2 供试品,1 2,如果供试品溶液在对照品溶液相应位置显示相同斑点，其颜色不得深于对照品溶液的主斑点,
