1、N 端和 C 端结构域在 P2X 内的组装是分散的单克隆抗体免疫共沉淀（抗 FLAG,抗 HA）的非离子洗涤剂过去也被用作为探针，通过考察 P2X2 缺失突变体和嵌合能力与在HEK293 细胞全长 P2X2 和 P2X3 亚基的关联来探查在 HEK293 细胞中P2X2 受体装配 100。免疫共沉淀显示无论是胞内功能区的 N 端还是C 端结构域（直到 28rP2X2 残基和 362rP2X2 远端残基，分别对应 30zfP2X4 和 370zfP2X4）都不是全长 rP2X2 或 rP2X3 亚基细胞表面表达和组装所必需的。此外，通过 7nAChR 信号肽裂解置换 rP2X2 残基 1-50
2、（包括整个 TM1 螺旋）并没有阻止全长 rP2X2 或 rP2X3 亚基的免疫共沉淀，这些数据在很大程度上排除了胞质内 N 端或 C 端结构域或 TM1 螺旋在亚基识别方面的序列特异性作用。100BN-PAGE 直接显示了胞内 C 端结构域的三聚体的分散性，表明了 hP2X5 结构可以控制 exon-10 residues (hP2X5+exon10)的插入，但是缺乏整个细胞内 C 端结构域（residues R365hP2X5+exon10 onwards）也可以和同源三聚体一样高效率的组装。101这三种基本残基覆盖在突变体胞内 C 端结构域的最末端。363KKR365 hP2X5+exo
3、n10 （对应着365KKR367zfP2X4)最有可能作为符合 “正电荷居内规则”的拓扑基因的信号102。由截去 zfP2X4 结构(residues 27-381zfP2X4 对应 25-379hP2X5+exon10) 的 N 端和 C 端结构域组成的同源三聚体晶体结构证实了 N 端结构域和至少一部分 C 端结构域的组装是有分散性的。TM2 通过限制胞外结构域的折叠空间影响组装通过观察截去了 R304rP2X2 （对应着 R312zfP2X4 or R310rP2X5 见图5A5A ）并且删除了 pre-TM2区（相当于 strand 14 of the zfP2X4 结构）可以推断出
4、TM2 螺旋在同源和杂合三聚体中扮演着重要角色，并且 TM2 螺旋阻止了全长 P2X2 或 P2X3 亚基的组装以及自我的组装100。这种观点是通过两嵌合体组成的胞外段两侧的包括 rp2x3 跨膜螺旋（x3-x1-x3） ，反之亦然（x1-x3-x1）的 P2X1 N-和 C-末端结构域的免疫共沉淀实验进一步支持100。在 HEK293 细胞中，理由是 WT P2X6 可以装配 rp2x1但不与 rp2x3 共表达103。有趣的是，x1-x3-x1 嵌合体可以与 WT rp2x6 亚基共沉淀，而 x3-x1-x3 和 WT P2X3 不行100,103。这一发现被解释为支持一个观点，TM 螺旋
5、怀有对 P2X 亚基组装很关键的特异识别基序。为了研究在 P2X 亚基组装中 TM2 螺旋的作用，我们利用 WT P2X5 亚基发生在人类仅仅作为一种缺乏 pre-tm2 区和大部分的 TM2螺旋由于剪接 10 外显子跳跃自然缺失突变体的事实（图 5A5A）指定为 hP2X5328-349， 而 hp2x5328-349 不作为一个功能性的 ATP 门控离子通道表达。WT rp2x5 cDNA，其中包括 exon-10 密码子，导致典型的 P2X 受体介导的电流表达104。通过 BN-PAGE，我们可以证明，全长 rp2x5 亚基高效的组装为三聚体，而 exon-10-lacking hp2x
6、5 只形成高阶的聚集体，完全保留在内质网101。尽管这些研究结果证实，TM2 螺旋对 P2X 亚基的高效组装是绝对必须的，但是认为 TM2 螺旋能够提供特定亚基识别信息 100 原来是站不住脚的，至少对于 P2X5 亚基来说。结果的发生是因为由于广泛的丙氨酸和亮氨酸的块替换使 TM2 螺旋通道功能受损，但是分别通过限制性蛋白水解与 BN-PAGE 显示扰乱折叠或者三聚体均不能做为探针。在 exon-10-lacking hp2x5 亚基的情况下（hp2x5328-349）丙氨酸拉伸的足够长，排除了疏水性不匹配，而是被迫通过剪接跳过一半的 TM2 螺旋激活组装的同源三聚体和跨膜段的形成101。总
7、之，这些发现与全长 TM2 螺旋对同源三聚体的作用是作为二膜锚的支架的观点完全契合101。通过 C 端结构域的末端与细胞膜的链接，TM1 和 TM2 之间形成了一环状结构，限制了胞外结构的空间移动，并且因此限制了折叠空间。这种结构可以通过识别细胞表面帮助正确定位以及允许更高效的碰撞发生，从而防止相邻型之间的聚集来协助组装。所有第二跨膜结构域的形成的序列操作，包括包括在 hp2x5 外显子 10 缺失（图5a5a）也会造成严重的亚基聚合。关于同源亚基与亚基之间相互作用的特定信息必须位于胞外段101的研究的结论通过 zfp2x4 晶体结构被支持。表明亚基间的联系主要由胞外区提供1,2 。三种 TM
8、1 螺旋在三种 TM2 螺旋的外面，这种结构形成了线性排列的中心离子通道2。在 TM2 螺旋内（在Leu340zfP2X4, Leu346zfP2X4 and Ala347zfP2X4 之间）有一些膜内连接，用于稳定关闭的通道。在 ATP 结合的反应中，当 TM 螺旋从中央轴移动到开放的通道时，这些膜内连接便破裂了。因此，尽管出现了明显的差异，但是同时，新的稳定开放通道的亚单位链接（包括Leu346zfP2X4 and Ile355zfP2X4）也形成了。D355rP2X5，由拓扑算法预测属于 TM2 螺旋，是唯一确定支持hp2x5 亚基同源三聚体相关程度的的热点残基101。D355 rP2X
9、5 通过穿过所有 7 种 P2X 受体亚型被保护起来。我们认为它是一个有趣的候选，作为组装的中介，在 TM1 螺旋的末端残基驱动二聚体或者三聚体形成的过程中105,106。然而根据 zfP2X4 受体的晶体结构，相应的 D357zfP2X4 残基应局限在 TM2 螺旋末端内侧（图 5B5B） 。在这个位置上，相比于亚基的组装，通过其带负电荷的链身与脂质头部基团相互作用在 TM2 螺旋与细胞膜之间发挥更好的作用。TM 螺旋在 P2X 受体功能性上的相互作用虽然事实上形成成熟的同源三聚体结构并不需要特定序列 TM2之间的相互作用，但是不能够排除 TM 螺旋作为 ATP 门控通道对P2X 受体的功能
10、起着重要的作用。的确，有证据通过洗涤剂表明通过 zfP2X4 受体结构能够使包装松散的 TM 螺旋显露出来，这些洗涤剂总是优先占据体积较大，围绕大的水溶性膜蛋白的疏水区域107。支持这一观点的证据来自观察:在 zfP2X4 结构中的高度倾斜缠绕的TM 螺旋会导致极薄的疏水层的形成（ 20 ） ，这些疏水层太薄以至于无法跨过原生膜。The suggestion that the intermonomer fenestrations seen in the structure leave the channel pore open to the fatty acyl environment 107
11、 could be demonstrated by a molecular dynamics simulation of the membrane-embedded zfP2X4 。相对温和的 TM 螺旋结构重排，足以提高疏水性的不匹配，并且通过 TM 螺旋更紧密的组装导致在膜之间形成了一个内界面108。以下的两个界面是确定的：(i)TM 残基 L351rP2X2，一个亚基的 I355rP2X 和W358rP2X2 与相邻 TM2 螺旋上的 L346rP2X2, A347rP2X2 和 V354rP2X2 相互作用。(ii)TM1 残基 Y45rP2X2 和相邻 TM2 亚基的 L340rP2
12、X2 相互作用108。大量关于在打开状态的膜内嵌入受体内的紧缩 TM 螺旋包装的计算和实验证据也能从在每个独特的亚单位中 rP2X2 受体内的S345CrP2X2, C348rP2X2 (TM2)和 H/C33rP2X2 (TM1)之间的金属桥梁的功能分析推断出来108。The close intrasubunit proximity of TM1 and TM2 was also evident from disulfide trapping experiments of an H33C/S345CP2X2mutant【109】 。有趣的是，李和他的同事早在 2010便提出了一个观点，即在关
13、闭状态的 zfP2X4 结构中，在孔区亚单位与亚基之间的相互作用受闸区的限制，这表明在通道开放时孔隙增大，其他亚基亚基之间的链接可以稳定孔区结构，同时表明 TM1残基 H33 与在开放孔区内的相邻的两个 TM2 上的残基 S345 相互作用6。基于 ZFP2X4 晶体结构的测绘基础点为了确定对 zfP2X4 亚基组装有潜在作用的连接斑块，我们可视化溶液可及的 van der Waals 表面相互作用根据表面的疏水性和静电电位相互作用（图 22） 。通过考虑相邻两个亚基之间的原子 4.5 的 van der Waals 表面区域 ，亚基与亚基之间的接触面在开放和关闭的状态下可以被可视化 图 33
14、） 。相邻亚基通过静电作用或通过氢键或疏水的特殊残基（范德华力）被列出在表 11 中。图 2表面暴露的侧链与 zfP2X4 亚单位相互作用，显示的是在受体单个亚基上的表面暴露侧链在载脂蛋白封闭状态下的表现(left panel; PDB entry 4DW02)，并且结合 ATP 开放了相邻两个 zfP2X4 亚基的接触面。图 3表 1基于 zfp2x4 受体的晶体结构的亚基与亚基间相互作用位点的计算预测，在小于 4.5 的 zfp2x4 受体的晶体结构中通过应用该过滤器的标准计算的数据224,225。ATP 结合位点在最近一些关于这个课题优秀的综述中提及了几位优秀的审稿人，同时包含广泛的背景
15、信息110-115。这些综述中包含了关于结合 ATP 的几个突变残基的特别全面的和有价值的表格概述116 。在预期集中在胞外结构域的晶体结构中尝试定位 ATP 结合位点，这些位点被保护在 7 种 P2X 受体的亚基中。相应的残基突变为丙氨酸或者半胱氨酸，而且表达的突变体的电生理特点可以与 ATP 的动作电位相比。这种方法确定了一系列的带正电荷的残基（通过上标来表明 P2X 的种类和亚基） ，例如 K68hP2X1, K70hP2X1, R292hP2X1 and K309hP2X1（对应 K70zfP2X4, K72zfP2X4, R298zfP2X4 and K316zfP2X4） （图44
16、，5D5D） ，残基末端 T186hP2X1 and N290hP2X1 (T189zfP2X4 and N296zfP2X4) （图 44，5D5D） ，芳香族残基 F185hP2X1and F291hP2X1 (F188zfP2X4 and F297zfP2X4)和其他34.117-132。实验证据表明，ATP 结合位点（S）可以在两相邻亚基的界面产生氧化反应，通过半胱氨酸的亚单位交联键被残基取代，这个过程对于 ATP 高效的运作是必不可少的。当rp2x1 受体在非洲爪蟾卵母细胞表达时，在两个被代替的两个位于胞外结构域的半胱氨酸 K68CrP2X1 and F291CrP2X1（图 5E5
17、E）之间自发形成亚单位交联键133。其他六对残基的半胱氨酸突变(K70 rP2X1, F185rP2X1, K190rP2X1, R292rP2X1, R305rP2X1, and K309rP2X1)没有导致亚单位交联键形成。图 4在 zfp2x4 亚单位受体激动剂结合位点内 ATP 的配位，在 PDB entry 4DW12显示了在 ATP 复合体中开放状态下的 zfP2X4 受体结构的亚单位 ATP 结合区域，选择多肽主链的副链此外，在一个基于赖氨酸残基，与 ATP 的结合和位于附近的受体胞外段两端的丙氨酸替换的研究 K69rP2X2 and K308rP2X2 以及 K68rP2X3
18、and K299rP2X3 对 rp2x2 和 rp2x3 受体结合的 ATP 是必不可少的，得出的结论是，受体激动剂结合位点位于两相邻亚基的亚基之间的界面129。最终确认这些代表 ATP 结合槽的亚单位槽由 ATP 结合的开放状态的 zfp2x4 受体的结晶提供2。三磷酸链和 ATP 分子腺嘌呤环形成U 形结构在 ATP 结合槽内。ATP 的磷酸氧化是由一条链上的 K70zfP2X4 and K72zfP2X4 和相邻的另一条链上的 N296zfP2X4, R298zfP2X4 and K316zfP2X4相互配合的（图 44） 。与半胱氨酸的巯基反应的 ncs-atp P2X2 受体突变体
19、的一致性显示，L191 zfP2X4（见图 5F5F，与 L186rP2X2 相对应）与I232zfP2X4 之间的疏水相互作用使 ATP 的腺嘌呤相互协调。腺嘌呤基通过 T189zfP2X4 的侧链和主链上与 K70zfP2X4 主链的氢键使其更加稳定2（图 44） 。核糖通过 L217zfP2X4 疏水键相互作用部分分解被认为是唯一的2。在不同受体不同亚基上的 ATP 结合位点的特殊序列最近通过同源建模被发现134。突变数据的结构解释提供了关于 ATP 结合关键观点E52-G96hP2X1 胞外残基的半胱氨酸扫描诱变结合综合药理分析，通过巯基特异性试剂显示的 32P2-azido-ATP
20、交联键和半胱氨酸突变体确定 K68hP2X1, K70hP2X1 and F92hP2X1 残基分别激活或抑制 hP2X1 受体通过受体激活剂和拮抗剂苏拉明135。绘制 E52hP2X1-G96hP2X1 与hP2X1 侧翼区的半胱氨酸扫描突变体模型的数据127,128 和在硅分子上对接的 ATP 和 BzATP 提供的 ATP 结合位点的同源模型与实验数据一致135。hP2X3 丙氨酸突变体的功能分析确定了保守残基对 ATP 结合在hp2x3 受体上很重要，包括基本残基 K63hP2X3, K65hP2X3, K176hP2X3, K299hP2X3 and R281hP2X3 （图 5D5
21、D）残基末端 G66hP2X3, N177hP2X3, N279hP2X3, and T172hP2X3 和芳香烃残基 F171hP2X3 and F280hP2X3。hP2X3 受体上已知残基的同源模型的预测显示在 ATP 识别方面，残基在亚基界面上是以组的形式被聚集成一组残基，而不是单个残基136。在使用 8-thiocyano-atp（ncs-atp）衍生物与 ATP 分子的腺嘌呤环的位置 8 的巯基反应组的巧妙的研究中，P2X2 受体的 ATP 结合位点被暴露出来3。半胱氨酸在相邻两个亚基上被取代，并且分开18 (N140CrP2X2 and L186CrP2X2; 图. 5F5F)，
22、这个现象说明通过 NCS-ATP 被共价标记了的被追踪的受体处在共价结合状态，并且通过栓系的位置，增强(L186C rP2X2)或减弱(L140C rP2X2)调节门控通道的能力。这些结果表明在亚基界面的 ATP 结合位点在 ATP 上的定位受限于受体调节门控通道的概率3 。在随后的研究中 NCS-ATP 受限于L186CrP2X2 产生的 ATP 结合位点构象的改变，但是不会改变通道的开放，这表明调控和预激活状态的存在指导 P2X2 受体的门控通道137。关于 P2X1 受体的电压钳法研究用四甲基马来酰亚胺(TMRM)标记的半胱氨酸残基取代在位于 C117rP2X1/C126rP2X1 之间
23、（图 5G5G）的第一保守二硫桥之间的拉伸的残基，C117 rP2X1/C126rP2X1 定位在头域的基部，用于分析 ATP 的激活，门控通道和脱敏现象10。通过同源模型和 ATP 对接的三维演示表明头域的基部对着 ATP 结合位点，ATP 的核糖集团对着细胞液，解释了实验数据。TMRM 与经过设计的半胱氨酸残基共价链接表明了配体的结合(N120C rP2X1, E122CrP2X1, and G123CrP2X1)，构象改变与通道开放的关联(G115C rP2X1 and G124CrP2X1)，和脱敏现象(P121C rP2X1 and I125CrP2X1) 10。荧光 ATP 衍生的
24、 Alexa-647-ATP 可以作为可视化配体结合和分离有效的工具。P2X1 受体的持久脱敏特点是缓慢释放拮抗剂和激动剂诱导的受体内在化138。有趣的是，与巯基反应的荧光染料 Alexa-Fluor 546 C5-maleimide 一般 ATP 不敏感的 K69CrP2X2 突变体 P2X2 受体导致通道的门控（开放）对锌，酸性 PH 和缺乏 ATP 的情况做出反应139 ，这可能使活化机理研究独立于 ATP 结合。ATP 结合位点的内在动力学影响 ATP 的结合和随后的变构变化一项 hP2X3 受体的研究中利用在内部和亚单位区域之间的临近位置的分子动力学模拟及半胱氨酸氧化交联键的替换，例
25、如头区和背部，背部和左侧。它表明 ATP 结合位点会自发的发生构象改变，即使没有 ATP140。有趣的是，自发交联的 K201ChP2X3（背部）和V274ChP2X3（左侧部） （图 5H5H）能够阻止 ATP 结合在受体上，通过分析与 -meATP 均等的荧光 ATP 衍生物 BODIPY-TR ATP 。得出的结论是高构象的域构成的 ATP 结合槽是激活位点和活化受体的先决条件140。此外，在 zfp2x4 受体中 ATP 的识别是通过头域的内在动力学测定141。在左侧和背侧的因 ATP 产生和 ATP 缺乏的内在动力学改变引起的构象改变同样通过分子动力学和 zfp2x4 受体的简正波分
26、析法显示出来，并且通过在左侧和背侧的动力锌桥以及半胱氨酸的交联被证实142。开放 P2X 受体所需要的 ATP 分子由克隆 rp2x2 受体介导 ATPATP 的浓度反应引起全细胞电流产生的希尔系数为 2.0，表明激活位点需要一个以上的激动剂分子结合20。从对 rp2x2 受体介导的电流单通道记录 ATP 的浓度依赖性估计一个类似的 ATP 激活的希尔系数是 2.3 143。由此说明对于重要的配体结合位点的量化，希尔系数是不可靠的，即使在强大的正协同效应的情况下，希尔指数也只提供最低限度的结合位点数144。因此，希尔系数为 2.3 表明在一个有活性的 P2X2 受体至少有三个 ATP结合位点。
27、数据的动力学造模表明，结合位点是不独立的，只有在完全激动剂配体通道的时候才会开放，在缺乏 ATP 的情况下没有观察到通道的自发开放143。突变的 P2X 受体同源-异源三聚体与动力学建模相结合提供了不同的观点。通过示范每个 P2X 受体结合两个 ATP 分子对于门控通道是足够的86,145-149。每个同源三聚体只有一个 ATP 结合位点的占位不能产生足够引起检测的内部电流，但是能产生未占位位点的ATP 结合位点构象的改变3,137,150。这种构象变化主要是促进了第二个和第三个 ATP 分子的结合表明了正协同作用的结构相关性在电生理学研究的早期被发现143。此外，光亲和的荧光 rp2x2-x
28、1 嵌合体和 rp2x2 受体和通过电压钳法的分析表明在随后的激动剂结合，预先激动剂表现出增加门控效率的现象137,150,152。ATP 构象改变可产生中间通道关闭状态。嘧啶和二磷酸核苷酸类似物，如 ADP，UTP 和 CTP 在结合三个位点中的一个是有效的150。通过同源对接和诱变显示竞争性拮抗剂的结合hP2X1 受体突变体 K68AhP2X1 and K309AhP2X1 会导致 ATP 效力最大的减少，但不影响对抗作用117。这些以及类似的 hp2x1 受体的芳香族氨基酸残基导致的结果引发的是否为 ATP 的结合位点和苏拉明结合的结合位点是不同的问题120。DdP2X 对常见的 P2X 受体阻滞剂苏拉明， PPADS 和 TNT-ATP 治疗不敏感34。ddp2x 受体缺乏一个在哺乳动物的 P2X 受体发现的重要的部分，就是富含半胱氨酸的头域，在对 NF449 敏感的人 P2X 受体和对 NF449 不敏感的 DdP2X 受体之间的嵌合体和 hp2x1 和 hp2x2突变体的药理分析显示集群中的正电荷残基( 136KAKRKhP2X1)（图5I5I） 有助于苏拉明和 NF449 灵敏度的提升 153。因为这些集群正电荷对于 P2X2 受体来说是缺乏的，这些数据为 NF449 的效力不足153,154以及 P2X2 受体的相关衍生物155,157似乎提供了合理的解释。
