1、第九章 酶的非水相催化,酶作为催化剂的优点：高效的催化作用、高度的选择性 、反应条件温和等 酶受到的限制： 酶易失活；底物或产物抑制；通常仅在水溶液中表现出高活性；,水是酶促反应最常用的反应介质。,但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。,由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。,是否存在非水介质能保证酶催化？,长期的观点认为: 有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几乎毫无进展。,9.1 非水介质中酶学基础,1984年美国Klibanov AM在科学 上发表了
2、一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述。他们在仅含微量水的有机介质中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。并证实了酶在100高温下，不仅能够在有机溶剂中保持稳定，还显示出很高的催化转酯活力。 这一发现使原来认为生物催化必须在水溶液中进行的酶学概念发生了革命性的变化。,酶在非水介质中，由于酶处于一种与水极不相同的环境，不可避免地导致酶存在状态与酶结构的改变，在水相中建立起来的酶反应动力学及反应机制都不能直接应用于非水介质中。 它们不同于标准的水溶液体系，在这些体系中水含量受到不同程度的严格控制，因此又称为非常规介质。,酶在非水介质中的催化反应具有在许多常规水溶液中所没有的新特征和优
3、势： 可进行水不溶或水溶性差化合物的催化转化，大大拓展了酶催化作用的底物和生成产物的范围； 改变了催化反应的平衡点，使在水溶液中不能或很难发生的反应向期望的方向得以顺利进行，如在水溶液中催化水解反应的酶在非水介质中可有效催化合成反应的进行； 使酶对包括区域专一性和对映体专一性在内的底物专一性大为提高，使对酶催化作用的选择性的有目的的调控的实现成为可能；,大大提高了一些酶的热稳定性； 由于酶不溶于大多数的有机溶剂，使催化后酶易于回收和重复利用； 可有效减少或防止由水引起的副反应的产生； 可避免在水溶液中进行长期反应时微生物引起的污染； 可方便地利用对水分敏感的底物进行相关的反应； 当使用挥发性溶
4、剂作为介质时，可使反应后的分离过程能耗降低.,从上世纪八十年代中期开始，酶在非水介质中催化反应的研究十分活跃。 现已报导，酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶类；过氧化物酶、过氧化氢酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、多细胞色素氧化酶等氧化还原酶类和醛缩酶等转移酶类中的十几种酶在适宜的有机溶剂中具有与水溶液中可比的催化活性。,9.1.1非水介质体系,有机介质反应体系超临界流体反应体系气相介质反应体系离子液介质反应体系,有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构
5、和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。,超临界流体是指温度和压力超过某物质临界点的流体。可作为亲脂性底物的溶剂。具有扩散快、黏度低、传质好、产物易于分离、易调控反应的特性等优点。,酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。,酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。,酶促反应的有机介质体系,1、含微量水的有机溶剂单相体系； 2、与水混溶的
6、有机溶剂和水形成的单相体系； 3、水与有机溶剂形成的两相或多相体系： 4、反相胶束体系；不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。,1、含微量水的有机溶剂单相体系,用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固相酶悬浮在有机相中。 酶表面含有必需的结合水以保持催化活性(含水量2%)。 酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。,又称：水不互溶有机溶剂单相体系 、微水介质体系,固相酶结构上仍是柔性的，保证酶和底物结合时形成酶和底物的中间复合体。,2、与水互溶的有机溶剂单相体系,极性较大的有机溶剂与水形成均匀的单相溶液
7、体系。酶、底物和产物都能溶解在这均一体系中。 适用于在单一水溶液中溶解度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。,水互溶有机溶剂体系可以降低反应体系的冰点温度，使酶催化反应在0以下进行时。,3、非极性有机溶剂-水两相体系,由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相反应体系。 亲水性物质（酶）溶于水相，疏水性物质（底物或产物）溶于有机相。 反应发生在两相的界面上 振荡与搅拌,4、反胶束体系,反胶束是表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体。 在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。 反胶束体系能够较好地模拟酶的天然状态，在体系中，大多数酶能够保持
8、催化活性和稳定性。,反相胶束是在与水不互溶的大量有机溶剂中，加入表面活性剂后形成的油包水的微小水滴，也称为微乳液。它是热力学稳定、光学透明的溶液体系。,极性,非极性,底物,产物,有机溶剂,有机介质酶促反应的优点,1 有利于疏水性底物的反应。 2 可提高酶的热稳定性. 3 能催化在水中不能进行的反应 4 可改变反应平衡移动方向 5 可控制底物专一性,6 可防止由水引起的副反应。 7 可扩大反应pH值的适应性。 8 酶易于实现固定化。 9 酶和产物易于回收。 10 可避免微生物污染。,9.1.2非水介质中酶的结构与性质,(一) 非水介质中酶的状态 在有机溶剂中，酶分子不能直接溶于其中，它的存在状态
9、有多种形主要分为两大类 第一类为固态酶，它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固体形式存在有机溶剂中。还有利用结晶酶进行非水介质中催化反应和酶结构的研究，结晶酶的结构更接近于水溶液中酶的结构，它的催化效率也远高于其他类型的固态酶。 第二类为可溶解酶，它主要包括水溶性大分子共价修饰酶和非共价修饰的高分子酶复合物、表面活性剂酶复合物以及微乳液中的酶等。,酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”，而又有“柔性” 的状态。 “紧密”状态主要取决于蛋白质分子内的氢键。溶液中水分子与蛋白质分子之间所形成的氢键使蛋白质分子内氢键受到一定程度的
10、破坏，蛋白质结构变得松散，呈一种“开启” 状态。,“钢性”与”柔性”的动态平衡,(二)非水介质中的酶学性质,由于有机溶剂的存在，改变了底物存在状态和酶和底物相结合的自由能，而这些会影响到有机溶剂中酶的热稳定性、底物特异性、立体选择性、区域选择性和化学键选择性等酶学性质。,1热力学稳定性,有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高。 原因：（1）酶结构刚性增强；（2）水含量有限。,（1）酶结构刚性增强：酶的亲水区与水相接触，环境中的水分子与酶蛋白功能团之间能形成氢键，使蛋白质形成具有柔韧性的空间结构，称为“开启”型空间结构。有机溶剂中水的缺乏，使酶蛋白分子内的氢键增多，酶分子结构刚性增强。
11、 同时处于有机溶剂中时，酶分子的疏水区暴露，分子折叠受到一定程度的破坏，带电基团之间相互作用形成非活性的“封闭”构象。酶分子结构刚性增强，对受热而引起折叠松散的抗性增强，热稳定性提高。,（2）水含量有限：由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，因此由水而引起的酶分子中天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用，天冬氨酸肽键的水解，二硫键的破坏，半肮氨酸的氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活的全过程难以进行。例如：胰脂肪酶在100的水溶液中，很快完全失活，但在100含0.02%水的三丁酸甘油酯中，作用12小时，仍保留50%的酶活。胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中，于20保存5个月活力不损失，而在水溶液中，其半衰
12、期只有几天。,某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性,在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。例如，核糖核酸酶在非水相介质中的水含量从0.06g/g蛋白质，增加到0.2g/g蛋白质时，酶的半衰期从120min减少到50min。,2底物选择性,在非水介质中，由于酶分子结构发生变化，致使酶的底物选择性会发生一些改变。 原因：在水溶液中，底物与酶分子活性中心的结合主要依靠疏水作用，所以疏水性较强的底物，容易与活性中心部位结合，催化反应的速度较高；而在有机介质中，有机溶剂与底物之间的疏水作用比底物与酶
13、之间的疏水作用更强。所以疏水性较强的底物容易受有机溶剂的作用，反而影响其与酶分子活性中心的结合，催化反应的速度较低。,不同的有机溶剂有不同的极性，所以在不同的有机介质中，酶的底物选择性也不一样。一般来说，在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易进行反应；在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易进行反应。,3对映体选择性,酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力，这种选择性是由两种对映体的非对映异构体的自由能差别造成的。 有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲(疏)水性的变化而发生改变。,4.位置选择性,（kcat/Km ）1/（kcat/Km ）2与溶剂的疏水
14、性相关,酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性（regioselectivity），即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。,5化学键选择性,化学键的选择性是非水介质中酶催化的一个显著特点。 化学键选择性是指当同一个底物分子中有2个以上的化学键都可以与进行反应时，酶对其中的一个化学键可以优先进行催化反应。在有机介质中进行酶催化反应时，化学键选择性可能变化。这种选择性与传统的化学催化完全相反，这样就可以在不需基团保护的情况下进行催化反应。,6pH记忆和分子记忆,pH记忆：有机溶剂中的酶能够保持它冷冻干燥前或吸附到载体上之前所在缓冲液中的pH。 因为酶在冻干或吸附到载体之前，先置于一定
15、pH值的缓冲液中，缓冲液的pH值决定了酶分子活性中心基团的解离状态。 利用酶的pH记忆特性可以控制有机相中酶催化的最适pH。,有机相生物印迹酶,枯草杆菌蛋白酶溶液 含N-Ac-Tyr-NH2,冻干,除去抑制剂,枯草杆菌蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶溶液 不含N-Ac-Tyr-NH2,冻干,枯草杆菌蛋白酶,在辛烷中催化酯化反应的速度比较：,反应（1）中得到的酶比反应（2）中得到的酶高100倍,在水溶液中其活性 ：,相同,（1）,（2）,酶蛋白,抑制剂,冻干,除去抑制剂,有机溶剂,水溶液,枯草杆菌蛋白酶的分子记忆,分子印迹技术原理：竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构
16、象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。 分子记忆:酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。,9.1.3水对有机介质中酶催化的影响,酶溶于水，有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和产物的溶解度有关。 维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。 有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水含量。,1、水对酶分子空间构象的影响,酶的活性构象的形成是依赖于各种氢键、疏水键等非共价相互作用。 水参与了氢键的形成，而疏水相互作用也只有在有水参
17、与时才能形成。因此水分子与酶分子的活性构象形成有关。,把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。正因如此，才能使用有机介质代替水溶液，进行酶促反应。 与酶分子起作用的只是与酶分子紧密接触的一层束缚水，只要保证这些基本必需的水分子固定在酶分子表面，而水溶液中其他大部分的自由水尽可以被有机溶剂所代替。,必需水：紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量的水称为必需水（或结合水、束缚水）。,有研究表明：在不同极性有机溶剂的低水反应介质中，随着溶剂的亲水性增大，保持在糜蛋白酶表面的束缚水下降2.51.0，而酶活性随之下降了10000倍。酶在完全干燥的溶剂中通
18、常没有活性。所以体系中有足够的水分对酶的催化起着重要的作用。,酶活性,含水量,最适含水量,0,动力学刚性,热力学不稳定,在特定的有机介质反应体系中，催化速度达到最大时的含水量称为最适含水量。,2、水对有机介质酶催化反应速度的影响,过多水分子,酶活性部位形成水簇,产生介电屏蔽,酶聚集成团,产生传质阻力,降低蛋白质分子带电氨基酸和极性氨基酸之间的相互作用,疏水底物较难进入酶的活性部位,含水量低于最适含水量,酶分子的构象刚性过强,含水量高于最适含水量,酶分子的构象柔性过大,构象变化,刚性：生物大分子结构的精确性 柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。,在非水介质中，只有在最适水含量时，蛋白质结
19、构的动力学刚性与热力学稳定性之间才能达到最佳平衡点，酶才表现出最大活性。 实验表明，水合作用能促进酶反应，而过量的水会导致酶活性下降。 a不同酶需水量不同 b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同。溶剂疏水性越强，需水量越少,“刚柔并济”,表征必需水作用的参数-热力学水活度,水活度（water activity，Aw）：在一定的温度和压力下，反应体系中水的蒸气压与同样状态下纯水蒸气压之比。 AwP /P0 水的存在状态分游离态和结合态，水活度即表示了这两种状态的存在比例。 该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。,酶的活性取决于吸附在酶分子上的水分而与溶剂中的水含量无关
20、。,9.1.4有机溶剂对酶催化反应的影响,1、有机溶剂对酶结构与活性的影响：酶分子与溶剂直接接触，有机溶剂能 “剥去”维持酶催化所必需的水，破坏氢键，降低分子表面张力，促使蛋白质方式去折叠而变性。应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。,有机溶剂能渗透入酶的活性中心,降低活性中心的极性，从而增加酶与底物的静电斥力，因而降低了底物的结合能力,作为底物的竞争性抑制剂与底物分子竞争在酶活性中心的接合点,溶剂极性越弱，这一效应可能越强,酶在有机介质中催化时其底物的km值会比在水里时显著增大,溶剂极性参数logP（P为溶剂
21、在正辛醇和水双相体系中的分配系数）来描述溶剂极性与酶活的关系。 logP可描述溶剂的极性 在加入等量水时：溶剂的logP 越高，酶活性越大，所需最佳水量越少。,2、有机溶剂对底物和产物的影响,有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。 有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度，而底物必须渗入必需水层，产物必须移出此水层，才能使反应进行下去。 极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。,9.2 酶在非水介质中的催化反应及应用,一、酶催化反应的类型 1 C-O键的形成 (1)酯类 酯酶和脂肪酶可催化酯合成反应、转酯反应和酸酐
22、水解反应。,酶催化的酯合成可以合成手性化合物而且酶的立体选择性主要是选择立体异构的醇。,其它,C-N、C-C、氧化还原等,二、 非水相催化的应用,有机相中酶催化研究最多的酶为水解酶(包括脂肪酶、蛋白酶、酯酶等)。 因为，一方面水解酶不需要辅酶、使用方便、易于获得、价格便宜； 另一方面水解酶不仅能在水相或含水有机相中催化水解反应，而且还能在微水介质中催化酰化反应和酰基转移化反应，这些在有机合成中特别有用。, 光学活性物质：能使平面偏振光旋转的化合物为光学活性物质。 手性：一个具有光学活性的有机物不能与它的镜像重合。 对映异构体：两个互为镜像但不能重合的对映体称为对映异构体，它们旋光能力相同，但方
23、向相反。 外消旋体：等量对映异构体的混合物没有光学活性，成为外消旋体。 外消旋体拆分：即利用拆分技术将外消旋体的两个对映体分开。通过外消旋体的拆分可得纯的光绪活性物质。,药物立体异构药效的显著差异的根本原因是生物体的对称性破缺。 人体内的几乎所有生物大分子，也就是药物作用的一般靶点，基本都是具有手性的。因此，一对几何上对称的景象异构进入人体以后，因被机体作为完全不同的物质处理，而具有显著的药效差异。 某些药物的一种对映体有显著治疗作用，而另一种对映体几乎无作用。,手性药物的拆分,概念：手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物,手性药物两种对映体的药效差异,一种有显
24、著疗效，另一种有疗效弱或无效 一种有显著疗效，另一种有毒副作用 两种对映体的药效相反 两种对映体具有各自不同的药效 两种消旋体的作用具有互补性,Thalidomide,R-异构体为镇静药,（反应停）,S-异构体,有致畸胎作用,图2对映体的不同生理活性,沙利度胺（Thalidomide）,-天使还是魔鬼？,俗名“反应停”，早期作为怀孕妇女的止呕药使用,R-(+)-沙利度胺为镇静止呕药 S-(-)-沙利度胺有致畸作用,50年代末，在欧洲出现数千例短肢畸胎新生儿，一度震惊全世界,手性药物两种对映体的药理作用,20世纪90年代后，许多国家规定，凡结构中具有不对称因素的药物，即“手性药物”，必须拆分其相
25、应的立体异构体，并分别研究其药理、毒理和药物代谢性质。对已上市的消旋体药物，要重新评价其光学异构体的性质。对新申报的药品，一开始就要合成其光学异构体。,多效唑（paclobutrazol）,- 杀菌还是助长？,(2R,3R)-(+)- 杀真菌剂,(2S,3S)-(-)- 植物增长剂,问题：如果只需要杀死真菌，为什么也要 喷洒植物生长剂呢？,掺假食品和饮料的鉴别,-手性选择指纹图, 分析氨基酸可以鉴别掺假果汁比氨基酸更特殊的标记物：苹果酸，乳酸酯、酒石酸和丁二醇原料中手性选择指纹图即可以鉴别“原产地”，也使掺假产品难于蒙混过关,手性药物的拆分方法,分为：非生物法、生物法非生物法（机械分离法、 形
26、成和分离对映体异构法、 色谱分离法、 动力学拆分）,生物拆分法原理,实质即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性。,青霉素酰化酶及其催化作用,利用其底物专一性及对映体的选择性进行光学异构体的合成与拆分。,TW Wang, DZ Wei* et al., Structure-Based Stabilization of an Enzyme: The Case of PenicillinAcylase from Alcaligenes faecalis, Protein & Peptide Letters, 2006.,Shu-Lai Li
27、u，Dongzhi Wei*, et al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 2006 Shu-Lai Liu，Dongzhi Wei*, et al., Preparative Biochemistry & Biotechnology, 2006,青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分,水-乙酸丁酯双相体系中叔亮氨酸的拆分 消除副产物苯乙酸的抑制,青霉素酰化酶在氨基酸拆分中的应用,氧化葡萄糖杆菌高效催化合成米格列醇关键中间产物,（1）,（2）,（3）,关键：生物催化效率及反应专一性,氧化葡萄糖杆菌用于II型糖尿病首选药物米格列醇的生物合成,W Su, D
28、Z Wei*, et al., Tetrahedron: Asymmetry, 2004, 15(8):1275-1277. GK Gao, DZ Wei*, et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, Online first.,氧化葡萄糖杆菌催化制备D型乳酸全新反应,什么是生物柴油,生物柴油(Biodiesel)是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。,废弃的地沟油,工业废油,动物油脂,生物柴油,优点： （1） 具有良好的环境属性 （2） 具有较好的低
29、温发动机启动性能。 （3） 具有较好的润滑性能。 （4） 具有较好的安全性能。 （5） 具有良好的燃料性能。 （6） 具有可再生性能。,生物柴油的应用,柴油应用的主要问题“冒黑烟”, 我们经常在马路上看到冒黑烟的卡车。冒黑烟的主要原因是燃烧不完全，对空气污染严重，如产生大量的颗粒粉尘，CO2排放量高、氮氧化物和硫化物等。因此人们开发了柴油的替代品生物柴油。,浓烟滚滚的卡车,这就是黑烟,从生物质到生物柴油,生物柴油生产装备,美国生物柴油发展趋势,生物柴油的生产方法,目前生物柴油主要是用化学法生产，采用酸、碱催化油脂与甲醇之间的转酯反应，而生成脂肪酸甲酯。反应时间短，成本低。但在反应过程中使用过量的甲醇，而使后处理过程变得较为繁杂。能耗高；色泽深，在高温下容易变质；酯化产物难于回收；生产过程有废碱液排放.,新方法：生物酶法，在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子醇类的酯交换反应，生成小分子的酯类混合物。 条件温和，醇用量小、无污染排放。 缺点：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%60%，酶的使用寿命短。副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。,生物酶合成法,定义：即用动物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯。 优点：条件温和、醇用量小、无污染排放、甘油易回收、耗能低、污染小、对油脂要求低等,
