1、鸡胚接种技术,公共卫生学院 王德全,一、概况,1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。1938年Goodpasture和Burnet等应用鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次氏体。,近些年来由于组织培养技术和分子生物学技术的发展，鸡胚培养技术在某些方面已被其他技术所取代，但是其在痘类病毒、粘液病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究上仍然是很重要的。,病毒分离培养,鸡胚培养法的优点：1. 它的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒。 2. 是个整体，有神经血管的分布及脏器的构造。
2、 3. 来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。,鸡胚培养法的缺点：1. 一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。 2. 卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。 3. 某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递到鸡胚。 4. 通常鸡胚常常含有白血病病毒。 5. 在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。,二、鸡胚的结构与生理,鸡胚是由三个胚层发育起来的，即外胚层，中胚层和内胚层，它们构成胚胎的组织与器官。（约10日龄鸡胚的结构见图）,气 室,鸡 胚,卵黄囊,尿囊腔,羊膜腔,绒毛尿囊膜,卵 白,卵膜,鸡胚的管理 （一）鸡胚的选择
3、首选健康莱亨鸡受精卵，其壳洁白易于观察胚胎，其他受精卵也可使用。接种病毒的受精鸡卵应未感染已知病毒或其它微生物（如新城疫病毒或支原体等），最好来自无特定病原体（specified-pathogens free，SPF）鸡群，接种立克次体的受精鸡卵应来自未食用高浓度抗生素的鸡群。,鸡胚的孵育受精鸡卵孵育时不要擦洗，以免受细菌污染。最好用能自动调节温度、湿度、气流及翻卵的孵卵箱孵育。如没有，也可用普通恒温箱，但要在温箱中放一盛满水的方盘，以保持适当的湿度。孵育应在3739、40%70%的相对湿度下进行。湿度太高会使气室发育过度，而湿度过低又会导致气室发育不良，甚至造成鸡胚死亡。通气也很重要，如果空
4、气不流通，也可造成鸡胚死亡。为了避免胚胎膜粘连和胚胎发育不均匀，应每隔一段时间转动一次受精鸡卵。,检卵 在发育的早期，鸡胚不易辨认，要到45天后才容易看见。因此，检卵要在孵育45天后进行。活的鸡胚绒毛尿囊膜界线较明显，上面的血管清晰可见、成网状，可看到明显的胚胎自主运动。如果胚胎活动呆滞或不能自主运动，血管模糊、变细、折断脱落，绒毛尿囊膜界线模糊，说明鸡胚已濒临死亡或已经死亡。,接种前后都要检卵。接种前检卵是要了解鸡胚的存活情况，标记气室边界和胚胎位置；接种后检卵是为了观察接种后胚胎的状况。,发育正常胚与异常胚的辩别,1、正常胚 头照可见眼点明显，血管色鲜红，呈放射状；二照可见整个蛋除气室外均
5、布满鲜红血管（合拢）三照时蛋的小头看不到发亮部分（封门），气室界线边缘血管鲜红。 2、弱胚蛋 头照胚体小，呈低阶段纤细血管，眼点不明显；二照可见小头有0.5cm2以上区域无血管分布；三照时小头发亮，气室界线边缘的血管面较大。,3、死胚蛋,头照可见血点、血线或血环紧贴内壳面，血管色因氧化而比活胚深，有时散黄或有灰白色凝块；中期死胚特征是气室界线模糊，胚胎呈黑团状，常与壳粘连，不动，当手摇胚蛋时，胚胎随之转动，停止摇晃时也随之停止。而活胚时刻在活动；三照死胚的小头发亮，血管色深，气室界线模糊，蛋体发凉；对尚未出壳的也可用温水来判断将蛋放入40C温水中，凡是在水中轻微晃动的为活胚，反之则为死胚。,三
6、、材料,（一）受精鸡卵 （二）孵卵箱或恒温箱 （三）捡卵灯，照卵灯 （四）砂轮、三棱针 （五）卵盘、卵杯 （六）其它：1ml注射器，针头，2.5%碘酒，75%酒精，镊子，无菌生理盐水，毛细吸管，橡胶吸头，液体石蜡，蜡和胶布等。,四、接种技术,（一）活胚检查1.血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。2.胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎发红像出血样，有的呈现黑块。3.血管网是否丰满：发育好的鸡胚可见密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜，死胚则见不到这一现象。,第一天,胚盘直径0.7cm，胚重0.2mg，在胚盘明区形成原条，其
7、前方为原结，原结前端为头突，头突发育形成脊索神经管，中胚层的细胞沿着经管两侧，形成左右对称的呈方形薄片的体节4-5对，中胚层进入暗区在胚部的边缘出现许多红点，俗称血岛；,第二天,胚盘直径1.0cm，胚重3mg，卵黄囊羊膜绒毛膜开始形成，胚胎头部开始从胚盘分离出来，血岛合并形成血管，入孵25小时心脏开始形成，30-42小时后心脏开始跳运，可见到20-27对体节，照蛋时可见卵黄囊血管区，形似樱桃，俗称樱桃珠,第三天,胚长0.55cm，胚重20mg，尿囊开始长出，胚的位置与蛋的长轴垂直，开始形成前后肢芽，出现5个脑胞的原基，眼的色素开始沉着，有35对体节，照蛋时，可见胚和伸展的卵黄囊血管形似蚊子，俗
8、称“蚊虫珠”；,第4天,胚长0.77cm，胚重50mg，孵黄囊血管包围蛋黄达1/3，肉眼明显看到尿囊，羊膜腔形成，胚和蛋黄分离，由于中脑迅速生长，胚胎头部明显增大，舌开始形成，照蛋时蛋黄不容易转动，胚与卵黄囊血管形似蜘蛛，俗称小蜘蛛；,第5天,胚长1.0cm，胚重0.13g，生殖腺已性分化，组织学上可确定胚的公母，胚极度弯曲，整个胚胎成“C”形，可见指（趾）原基，眼的黑色素大量沉着，照蛋时可明显看到黑色的眼点，俗称单珠或黑眼；,第6天,胚长1.38cm，胚重0.29g，尿囊已达蛋壳膜内表面，卵黄囊分布在蛋黄表面的1/2以上，由于羊膜壁上的平滑肌收缩，胚胎有规律运动，蛋黄由于蛋白水分的渗入而达到
9、最大重量，由约占蛋重的30.01%增至65.48%，喙原基出现，躯干部增长，翅脚已可区分，照蛋时，可见头部和增大的躯干部两个小圆团，俗称双珠；,第7天,胚长1.42cm， 0.57g，尿囊液急剧增加，上喙前端出现小白点形的破壳器（卵齿），口腔鼻孔肌胃形成，胚胎已显示鸟类特征，胚胎自身有体温，照蛋时胚在羊水中不容易看清，半个蛋表面布满血管；,第8天,胚长1.5cm，胚重1.15g，肋骨肺胃明显可辨，颈背四肢出现羽毛，乳头突起，右侧卵巢开始退化，照蛋时胚在羊水中浮游，背面两边蛋黄不易晃动，俗称边口发硬；,第9天,胚长2cm，胚重1.53g，喙开始角质化，软骨开始骨化，眼睑已达虹膜，解剖时心肝胃肾肠
10、已发育良好，尿囊几乎包围整个胚胎，照蛋时可见卵黄两边易晃动，尿囊血管伸展越过卵黄囊，俗称窜筋；,第10天,胚长2.1cm，胚重2.26g，尿囊血管到达蛋的小头，整个背颈、大腿部都覆盖有羽毛，乳头突起、龙骨突形成，照蛋时可见尿囊血管在蛋的小头合拢，除气室外，整个蛋布满血管，俗称合拢；,第11天,胚长2.54cm，胚重3.68g，背部出现绒毛，腺胃明显可辩，冠锯齿状，尿囊液达最大量，照蛋时血管加粗，色加深；,第12天,胚长3.57cm，胚重5.07g，身躯覆盖绒毛，肾肠开始有功能，开始用喙吞食蛋白,第13天,胚长4.34cm，胚重7.37g，头部和身体大部分覆盖绒毛，胫趾出现角质鳞片原基，蛋白通过
11、浆羊膜道迅速进入羊膜腔，眼睑达瞳孔，照蛋时蛋小头发亮部分随胚龄增加而逐渐减少,第14天,胚长4.7cm，胚重9.74g，胚胎全身覆盖绒毛，头向气室，胚胎开始改变为横着的位置，逐渐与蛋长横平行,（二）接种途径1.尿囊腔接种：该途径一般用于流感、新城鸡瘟病毒和腮腺炎的适应和传代。 2.羊膜腔接种：这途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽漱液）分离病毒。 3.卵黄囊接种：该接种途径主要用于抗流感病毒药物实验。 4.绒毛尿囊膜壳块培养法：该法可用于流感病毒滴定、中和试验和药物实验。,1.尿囊腔接种 尿囊腔接种常用于流感病毒、新城疫病毒和腮腺炎病毒的适应和传代。进入尿囊腔的这些病毒，能够在尿囊的内胚层
12、细胞中大量繁殖，随后释放到尿囊液中。由于这一接种途径可获得大量的病毒，也常被用于大量制备抗原、疫苗等。,接种方法： 选911日龄鸡胚照检后，标出气室边界和胚胎位置。在胚胎面气室上方靠近边界23mm处，避开血管作一标记，用碘酒消毒标记处的卵壳，在标记处钻一孔，再次用碘酒消毒钻孔区，将注射器针头经孔刺入尿囊腔，注入0.10.2ml接种物，将蜡熔化封孔，3335孵育4872小时。每日照检，24小时内死亡的应弃去。,收获：收获前先将鸡卵置4冷冻618小时，如急于收获也可将鸡胚置-20、1小时左右。冷冻后的鸡卵钝端向上置于卵杯上，将气室上方卵壳用碘酒或70%的酒精消毒后去除，暴露壳膜，用无菌镊子小心地将
13、壳膜从绒毛尿囊膜上撕下，不要损伤绒毛尿囊膜。用注射器或吸管经绒毛尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液，置低温保存。同时做无菌培养。,2.羊膜腔接种羊膜腔接种主要用于从临床或现场材料（如患者咽漱液等）中分离病毒。接种到羊膜腔中的接种物能够被胚胎吞咽和进入呼吸管，可遍及各种组织和细胞，使具有特定细胞亲嗜性的病毒被充分利用，从而提高病毒繁殖的可能性。由于可收获的羊膜组织或羊水较少，为了使病毒适应在尿囊内胚层生长，从而获得大量的病毒，可将经羊膜腔接种分离到的病毒再经尿囊腔传代。,接种方法：选1012日龄鸡胚检卵后，标出气室边界和胚胎位置。用碘酒消毒鸡卵钝端（气室上方）的蛋壳，在气室上方靠近胚胎侧的卵壳上钻一孔
14、，钻孔区再次用碘酒消毒。用无菌眼科小剪子沿钻孔周围剪去少许，开一小窗，勿损伤内层壳膜，经小窗向气室内滴入一滴无菌液体石蜡。将卵置照卵灯上，可清楚地看到胚胎的位置。将注射器瞄准胚胎的腭下胸前，刺入后注入0.10.2ml接种物。用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将窗口封上。接种后的受精卵根据接种的病毒在33、35或37的条件下孵育4872小时。,收获：收获前先将鸡卵置4冷冻618小时，时间不能过长，过长会引起散黄。冷冻后的鸡卵钝端向上置于卵杯上，将气室上方卵壳用碘酒或75%的酒精消毒后去除，暴露壳膜，用无菌镊子小心地去除壳膜，使其与绒毛尿囊膜分开，不要损伤绒毛尿囊膜。用注射器或吸管经绒毛尿囊膜刺入尿囊腔
15、，吸出尿囊液。然后，一只手持镊子将羊膜轻轻提起，另一只手持注射器或吸管刺入羊膜腔吸取羊水，置低温保存。同时做无菌培养。,3.绒毛尿囊膜接种 绒毛尿囊膜接种常常用于分离和繁殖在绒毛尿囊膜上产生斑和痘的病毒，如牛痘、天花、单纯疱疹和鸟痘病毒。可在绒毛尿囊膜上滴定这些病毒，因为感染性病毒颗粒的量可以通过产生的斑和痘的数目来计算。还可用于抗体滴定试验，因为斑和痘的个数减少的程度与抗体浓度有关。,定位：将胎盘部分及自然气室部分用铅笔画出，在胎盘与蛋白交界处（无血管区）画一直径约1cm的等边三角形。,卵窗,气 室,鸡 胚,卵黄囊,尿囊腔,羊膜腔,绒毛尿囊膜,卵 白,卵膜,取卵壳：消毒后取下所画三角形区域的
16、卵壳，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺一小口（不要伤及绒毛尿囊膜）， 造人工气室：在自然气室部分用大注射器针头钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成一“人工气室”,接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毒0.10.2ml。 封口：用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。 培养：放入温箱培育4天，然后收获病毒。,收获： 收获前检卵，看人工气室是否仍然存在，如果不存在，轻轻地吸气室上的孔。用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去掉壳和壳膜至人工气室的边缘，尽量最大范围地暴露绒毛尿囊膜，用无菌剪子沿人工气室的边缘将接种病毒的绒毛尿囊膜剪下，低温保存。同时做无菌培养。,4.卵
17、黄囊接种卵黄囊接种常用于分离和繁殖立克次体，也可用于分离和传代衣原体。这些大的病原微生物易于在沿卵黄排列的内胚层细胞中生长。,接种方法：选用56日龄鸡胚，因为卵黄囊在这个阶段比较大，易于接种，并为病毒的繁殖提供了一个比较大的表面。检卵后，用碘酒消毒气室端卵壳，在气室中心的卵壳上钻一孔，再次用碘酒消毒钻孔处，将注射器的针头经钻孔沿卵的纵轴刺入3cm左右，进入卵黄囊中，通常注入0.51ml接种物。用蜡熔化封口，3537孵育38天，视接种的病毒或立克次体而定。,收获：先将鸡胚冷冻，去除气室上方卵壳，用无菌镊子揭去壳膜，撕开绒毛尿囊膜后，将鸡胚内容物倒入无菌培养皿中，注意要避免内容物沿卵壳流下而发生污
18、染。将鸡胚从卵黄囊上剪下，如收获鸡胚，则去双眼、爪和嘴，置无菌瓶中低温保存。倒出卵黄囊中的卵黄，用生理盐水将卵黄囊洗净，置无菌培养皿或烧瓶中低温保存。并取一块做无菌试验。,注意事项,鸡胚为一活的有机体，因此要严格无菌操作，同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种后24小时内死亡应不计结果。,收获物的检测 （一）无菌试验 鸡胚培养所收获的材料应当未受细菌污染。检查收获物是否受到细菌污染，可在收获时取一小块组织或将第一滴液体（如尿囊液）放入盛有23ml无菌肉汤的小试管中，37培养36小时。如肉汤依旧清亮透明，无菌落出现，说明没有污染；如肉汤变混浊，有絮状菌落出现，说明受到细菌污染。被细菌污染的收获物
19、应灭菌后弃掉。,病毒检测检测鸡胚培养的收获物中是否有病毒存在，有直接观察法和试验法两种方法。 1、直接观察法 有些病毒在鸡胚中繁殖，可对鸡胚产生眼睛可见的直接损害，可通过直接观察法确认病毒的存在。,这些损害有： （1）在绒毛尿囊膜上形成特殊的增生性损害或痘疱，如各种痘类病毒和疱疹病毒，常产生白色或灰色痘疱，并常伴有膜上血管充血，偶可见出血； （2）引起鸡胚死亡，如新城疫病毒、流行性乙型脑炎病毒，但应与接种损伤和细菌污染引起的死亡区别开； （3）造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓,2、试验法有些病毒在鸡胚中繁殖并不造成可见损害，直接观察无法确认病毒的存在，必须用试验加以证实。有些病毒能引起红细胞凝集
20、，可对羊水或尿囊液进行血凝试验证明病毒的存在，如流感病毒、新城疫病毒和流行性腮腺炎病毒等。还可以用特异性免疫血清与收获的液体或组织做补体结合试验来证明病毒的存在。,第五节 鸡胚接种技术的应用 一、人类与动物病毒的培养、 分离与鉴定,1流感病毒的分离和鉴定 病人须采集发病初期（一般为前3天）鼻咽洗液或含漱液，加青、链霉素杀菌后，接种于鸡胚羊膜腔内及尿囊腔中，35孵育24 d后，取羊水、尿囊液做血凝试验，检查有无病毒增殖。若试验为阴性，需在鸡胚中盲目传代三次后再试验。若血凝试验为阳性，可用已知流感病毒各型特异性抗体与新分离病毒进行血凝抑制试验鉴定型别。,2禽流感病毒的分离和鉴定 由于所有的禽流感病
21、毒毒株都能在鸡胚中增殖，所以用其进行分离培养AIV及其它研究最为常见。,3其他病毒的分离和鉴定 介绍一些病毒在鸡胚中的繁殖情况。,病 毒 胚龄（日）适宜接种途径 孵育 孵育 收获时间 温度 （）表现 材料 流行性感冒 912 尿囊腔、羊膜腔 3648h 3335 血凝 尿囊液、羊水 水痘 1013 绒毛尿囊膜 35d 37 痘疱 绒毛尿囊膜 牛痘 1012 绒毛尿囊膜 23 d 37 死亡、痘疱 绒毛尿囊膜 天花 1012 绒毛尿囊膜 3 d 37 死亡、痘疱 绒毛尿囊膜 流行性腮腺炎 912 尿囊腔、羊膜腔 57 d 35 血凝 尿囊液、羊水 流行性乙脑 68 卵黄囊 3 d 37 死亡 绒
22、毛尿囊膜 新城疫 911 绒毛尿囊、羊膜腔4 d 32 死亡、血凝 绒毛尿囊膜,二、疫苗的研制,流感疫苗是将流感病毒接种到鸡胚里，大量繁殖后经减毒或杀灭以后制成的，其有减毒活疫苗和灭活疫苗两种。活疫苗是用活的流感病毒经减毒处理以后制成的疫苗，灭活疫苗是把大量流感病毒杀灭后制成的。,病毒的红细胞凝集试验（HA）血凝素（hemagglutinin HA）：由病毒基因编码的糖蛋白刺突。与病毒吸附和传入宿主细胞有关。HA能与人或其它动物多种红细胞表面N乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。,Haemagglutination (HA),virus,No virus,一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许
23、多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。,二、应用 当动物感染某病毒而发病时，可在机体的相应器官查出病毒。 病毒进入动物机体，将发生特异性免疫反应，即产生免疫物质抗体，而抗体90%都存在于动物的血清中。,病毒相当于免疫效应物质中的抗原。 抗原和抗体发生特异性结合反应。 当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。,凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行HA试验，出现血凝现象的各稀释孔中，能出现病毒的红细胞凝集现象的病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价。,凝集价稀释倍数
24、中所含病毒数叫一个病毒的凝集单位。 在病毒的红细胞凝集抑制试验（HI试验）中，确定病毒的稀释倍数，应按含有4个病毒凝集单位为标准。,三、实验材料：96孔V型微量反应板、微量振荡器、病毒材料、红细胞悬液、生理盐水、微量吸液器、注射器、抗凝剂、离心机、恒温箱等。 四、方法与步骤： 制备鸡红细胞悬液： 用注射器抽取抗凝剂。,2.用上述注射器，采用无菌法抽取健康的未免疫鸡的静脉血，与抗凝剂等量。 3.混匀，加生理盐水适量，洗涤离心，共离心三次（第一、二次2000转/分5分钟、第三次3000转/分 8分钟）洗去血清及白细胞。 所余的纯红细胞，用生理盐水稀释100倍，即成1%的鸡红细胞悬液。,（二）按下表
25、顺序加样 弃去.025,（三）置于振荡器上振荡1分钟。 （四）37恒温箱20分钟观察结果。 （五）判定结果： （）凝集反应者，凝集的红细胞呈薄膜状，均匀的复满孔底，有的似有红细胞沉积于中央。 （）红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞。,6）观察结果： 一层红细胞均匀地铺于孔壁上者为+。 基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+。 红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为+。 红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。 如用鸡红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的眼泪样为-。 如用豚鼠或人红细胞形成一个小圆圈，边缘光滑无任何小凝集者为
26、-。 “”即为可疑，计算时以“-”（阴性）处理。,Haemagglutination,Dilution,2,4,8,16,32,64,128,256,512,prozone,titre,1024,No virus,病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）,一、 概念 病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，称血凝抑制。利用血凝素特异性抗体与病毒表面相应的HA相互作用，使病毒血凝现象抑制的试验称血凝抑制试验。,血凝原理,血凝抑制原理,血清学试验：体外的抗原抗体反应叫血清学试验。 HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称HI试验。 抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大
27、稀释倍数叫抗体效价。,二、动物体内抗体存在情况 病畜体内，因受病毒抗原刺激，产生大量相应抗体，故体内抗体效价较高。 健康动物，免疫接种后，因受疫苗（抗原）刺激，而发生免疫应答反应，体内抗体效价较高。,三、实验材料：微量血凝反应板、振荡器、微量移液器、生理盐水、病毒（4个血凝单位）、红细胞悬液、恒温箱、被检血清等。,四、方法与步骤：,血凝抑制试验结果判定,测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)凝集 （-） 血清对照孔：RBC沉于孔底，无自凝 病毒对照孔：凝集 RBC对照孔：无自凝 血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血清稀释度。,（五）判定结果： 诊断疫病抗体效价大于25或效价值参差不齐，并伴有相应病症者为阳性。抗体效价为24为可疑。抗体效价小于23为阴性。,免疫监测雏鸡母源抗体效价在23以下时，对免疫接种有应答反应，此时可以注谢疫苗，如不及时接种，有感染疫病的可能。成鸡抗体效价在25以下时，应立即注射疫苗。,
