1、,第十八章 全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪,内 容 提 要,第一节 全自动DNA测序仪一、工作原理 （一）双脱氧链末端终止法测序原理（二）新生链的荧光标记原理（三）荧光标记DNA的检测原理二、全自动DNA测序仪的结构与功能 （一）仪器的组成（二）仪器各组成部分的功能,内 容 提 要,三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护（一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护（二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护四、全自动DNA测序仪的进展五、全自动DNA测序仪的主要应用第二节 蛋白质自动测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能三、蛋白质测序仪的主要应用,前 言
2、,了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病，是生命科学的核心内容之一核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子，其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主要对象,前 言,核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结构核苷酸的线性排列构成它的一级结构 蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的一级结构是了解蛋白质功能的基础,第一节 全自动DNA测序仪,DNA测序 核苷酸序列早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列 缺点：既费时又不准确20世纪80年代以后 ：DNA自动测序仪 Sanger双脱氧链末端终止法 M
3、axam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确,一、全自动DNA测序仪工作原理,Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得DNA序列 双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动DNA测序仪中应用广泛,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,利用DNA的体外合成过程聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） DNA聚合酶的催化以目的D
4、NA为模板按照碱基互补配对原则在引物的引导下,单核苷酸聚合形成新DNA链,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为 4种2-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）,图18-1 dNTP结构示意图,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,测序反应体系中，加入的核苷酸单体为 2,3-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP）,图18-2 ddNTP结构示意图,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸
5、二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。,dNTPs,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,图18-3 双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,图18-4 双
6、脱氧链末端终止法测序反应原理（2）,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,图18-5 双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,图18-6 双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,图18-7 双脱氧链末端终止法测序反应原理（5）,（二）新生链的荧光标记原理,早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害、背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在DNA自动测序中得到广泛应用,（二）新生链的荧光标记原理,荧
7、光染料 标记法,单色荧光标记法多色荧光标记法,荧光标记引物法荧光标记终止底物法,荧光标记引物法荧光标记终止底物法,（二）新生链的荧光标记原理,多色荧光标记法 - 荧光标记引物法定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5端一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等按A、T、C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、C、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内电泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系,（二）新生链的荧光标记原理,荧光标记引物法,图18-8 荧光标记引物法原理,（二）新生链的荧
8、光标记原理,多色荧光标记法 - 荧光标记终止底物法定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息,（二）新生链的荧光标记原理,模板：T C C A T G A T 产物：A A G A G G A G G T A G G T A A G G T A C A G G T A C T,图18-9 新生链的荧光标记原理,（二）新生链的荧光标记原理,荧光标记引物法和荧光标记终止
9、底物法的异同点：都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一对应关系荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成 在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同一管中完成,（二）新生链的荧光标记原理,单色荧光标记法 也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止
10、底物法均需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳,（二）新生链的荧光标记原理,单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点：均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同一扩增管中进行，电泳时在同一泳道中电泳,（三）荧光标记DNA的检测原理,测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大多数产物均为单链反应结束
11、后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳 两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口 由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段,（三）荧光标记DNA的检测原理,DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信
12、号数据的集合经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来,（三）荧光标记DNA的检测原理,多色荧光标记技术检测优点：一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，提高了测序精度一个样品所有反应产物只需进样一次，所以一次实验便可以处理较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下，加样的工作量也大大减少,二、全自动DNA测序仪的结构与功能,全自动DNA测序仪平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细
13、管中（内径50m100m），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离,平板型电泳毛细管电泳,（一）仪器的组成,主机： 主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统 ；大致可分为自动进样器区 、凝胶块区 和检测区等结构功能区微型计算机各种应用软件,（一）仪器的组成 - PE310 基因分析仪,图18-10 PE310 基因分析仪的结构,凝胶块区,自动进样器区,检测区,（一）仪器的组成 - PE310 基因分析仪,图18-11 PE310 基因分析仪的主机分区,热板,毛细管,雷射检测器,注射器驱动杆,毛细管和电极,注射器,正极缓冲液,泵块,自动进样器,负极缓冲液,图18-12 PE310 基因
14、分析仪的基本结构,（二）仪器各组成部分的功能,1. 主机功能 具有自动灌胶、进样、电泳、荧光检测等功能 (1)自动进样器区功能 自动进样器受程序控制进行三维移动，因负极电极和毛细管均固定不动，故许多操作如毛细管进入样品盘标本孔中进样、电极和毛细管在电极缓冲液瓶、洗涤液和废液管中移动等均依靠自动进样器的移动完成；,（二）仪器各组成部分的功能,电极为电泳的负性电极，测序过程中，正、负极之间的电势差可达15000伏，如此高的电势差可促进DNA分子在毛细管中很快泳动，达到快速分离不同长度DNA片段的目的；样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本；电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用
15、。,（二）仪器各组成部分的功能,(2)凝胶块区功能 注射器驱动杆：给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中。在分析每一个样品前，泵自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶；样品盘按钮：控制自动进样器进出；注射器固定平台：起固定注射器的作用；电极：为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液中；,（二）仪器各组成部分的功能,正极缓冲液阀：当注射器驱动杆下移，将注射器内的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进入缓冲液；电泳时此阀打开，提供电流通道；玻璃注射器：储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力；毛细管固定螺母：固定毛细管；废液阀：在清洗泵块时控制废液流。,（二）仪器各组成部分的
16、功能,(3)检测区功能 激光检测器窗口及窗盖：激光检测器窗口正对毛细管检测窗口，从仪器内部的氩离子激光器发出的激光可通过激光检测器窗口照到毛细管检测窗口上。电泳时，当荧光标记DNA链上的荧光基团通过毛细管窗口时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，荧光经分光光栅分光后投射到CCD摄像机上同步成像。窗盖起固定毛细管的作用，同时可防止激光外泄；,（二）仪器各组成部分的功能,加热板：电泳过程中起加热毛细管的作用，一般维持在50；毛细管：为填充有凝胶高分子聚合物的玻璃管，直径为50m，电泳时样品在毛细管内从负极向正极泳动；热敏胶带：将毛细管固定在加热板上。,激光检测器检测特征性的荧光光谱,图18-1
17、3 激光检测器检测特征性的荧光光谱,DNA测序图,图18-14 DNA测序图,（二）仪器各组成部分的功能,2. 微型计算机功能 控制主机的运行，并对来自主机的数据进行收集和分析。设置测序条件（样品的进样量、电泳的温度、时间、电压等），同步监测电泳情况并进行数据分析 3.各类软件功能 承担数据收集、DNA序列分析及DNA片段大小和定量分析等功能。其结果可由彩色打印机输出,三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护,毛细管电泳型DNA测序仪 平板电泳型DNA测序仪,电泳时仪器显示无电流 电极弯曲 电泳时产生电弧 其它,电泳时仪器显示无电流 传热板粘住胶板 其它,（一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障
18、及维护,电泳时仪器显示无电流 电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管电极弯曲而无法浸入缓冲液中毛细管未浸入缓冲液中毛细管内有气泡等 电极弯曲 安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令，电极不能准确插入各管中运行前未将样品盘归位、或虽然执行了归位操作，但X/Y轴归位尚未结束就运行Z轴归位等,（一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护,电泳时产生电弧 主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积 其它 测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝胶干燥而阻塞毛细管定期清洗泵块定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管,（二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护,电泳时仪器
19、显示无电流 电泳缓冲液配制不正确电极导线未接好或损坏正极或负极铂金丝断裂正极或负极的胶面未浸入缓冲液中传热板粘住胶板 主要原因为上方的缓冲液室漏液,（二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护,其它 倒胶前应按照操作要求认真清洗玻璃板配制凝胶时应注意胶的浓度、TEMED含量、尿素浓度等倒胶时需注意不能有气泡将待测样品加入各孔前，应使用缓冲液冲洗各孔，把尿素冲去，以免影响电泳效果,四、全自动DNA测序仪的进展,Smith等于1986年首次建立了一种使用四种不同荧光分别标记四种不同碱基的方法 同年，Ansorge建立了一种使用单色荧光四甲基罗丹明作为标记染料的自动测序方法 平板法电泳是经典的电泳技
20、术，具有样品判读序列长（600bp900bp）、一块凝胶板上可同时进行多个样品测序（可达96个）的优点毛细管电泳为近20年来建立的一种快速、高效、进样量少、灵敏度高的新技术，可测序列达到750bp左右,四、全自动DNA测序仪的进展,单色荧光标记 四色荧光标记 平板型电泳 毛细管电泳,芯片实验室（lab-on-a-chip）缩微生物处理器（microfabricated bioprocessor），成功完成纳升级标本的Sanger DNA测序,四、全自动DNA测序仪的进展,图18-15 缩微生物处理器结构示意图,五、全自动DNA测序仪的主要应用,人类基因组测序人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断法
21、医的亲子鉴定和个体识别生物工程药物的筛选动植物杂交育种,第二节 蛋白质自动测序仪,蛋白质顺序指肽链中氨基酸的排列顺序通常从左至右表示肽链从氨基酸氨基端（N末端）到羧基端（C末端） 蛋白质测序仪工作原理：执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程,一、蛋白质测序仪的工作原理,Edman降解法,多肽链N末端NH2 PITC,弱碱,苯异硫甲氨酰肽,TFA,噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物 剩余多肽,弱碱,苯异硫甲氨酰肽,TFA,噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物 剩余多肽,PTH氨基酸,PTH氨基酸,HPLC,HPLC,一、蛋白质测序仪的工作原理,上述降解循环的偶联和环化发生在测序仪的反
22、应器（筒）中，转化则在转化器进行。转化后的PTH氨基酸经自动进样器注入高效液相色谱(high performance liquid chromatogram, HPLC)进行在线检测。根据PTH氨基酸的洗涤滞流时间确定每一种氨基酸。,二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能,测序反应系统 主要部件为反应器 氨基酸分析系统 由高效液相色谱毛细管层析柱组成 信息软件处理系统 根据氨基酸的层析峰来判断为何种氨基酸,三、蛋白质测序仪的主要应用,新蛋白质的鉴定 在凝胶电泳中出现的未知条带可以利用蛋白质测序仪来测定其序列 分子克隆探针的设计 用蛋白质序列信息设计PCR引物和寡核苷酸探针。可以利用这些探针进行
23、cDNA文库或基因组文库的筛选 抗原的人工多肽合成,本 章 小 结,DNA测序仪是检测核酸一级结构 - 核苷酸线性排列顺序的自动化仪器工作原理包括Sanger双脱氧链末端终止法或Maxam-Gilbert化学降解法在单纯以测定DNA序列为目的的全自动DNA测序仪中以双脱氧链末端终止法应用较广泛,本 章 小 结,其原理是利用DNA的体外合成过程，但与普通PCR不同的是，双脱氧链末端终止法测序反应中除有-脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入2-双脱氧核苷三磷酸（2-ddNTP），由于没有-OH，不能进行后续反应，使正在延伸的DNA链在此终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系
24、列长度不同的多核苷酸片段，通过电泳分离后可读出新生DNA链的序列,本 章 小 结,用荧光标记新生链时，分为多色标记法和单色标记法根据标记部位不同，又分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法荧光标记引物法的荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且两者在时间上有一定间隔荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成采用四色荧光标记进行测序反应时，一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，提高了测序精度,本 章 小 结,全自动DNA测序仪根据电泳方式的不同分为平板型电泳和毛细管电泳两种仪器类型
25、测序仪主要由主机、微型计算机和各种应用软件等组成，主机包括自动进样器区、凝胶块区和检测区等结构功能区,本 章 小 结,毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障包括电泳时仪器显示无电流、电极弯曲、电泳时产生电弧等平板电泳型DNA测序仪的常见故障包括电泳时仪器显示无电流、传热板粘住胶板等，应根据具体情况及时处理,本 章 小 结,蛋白质测序仪是检测蛋白质一级结构氨基酸排列顺序的自动化仪器目前的蛋白质测序仪实际上是执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程,本 章 小 结,蛋白质测序仪包括测序反应系统、分析系统和数椐处理系统主要应用于新蛋白质的鉴定、分子克隆探针的设计和抗原的人工多肽合成等方面,谢谢！,
