1、本科毕业论文（设计）题 目 基于纳米复合物的适体与免疫传 感器的制备与表征学 院 _ _化学化工学院_ _专 业 _ 化学（师范） _年 级 _2008 级_ 学 号 222008316011227 姓 名 _李 康_ _指 导 教 师 _ 许文菊_ _ 成 绩 _良_ 2012 年 4 月 9 日2目 录摘要 1关键词 1Abstract.1Key words .11 引言 11.1 基于新颖的氧化石墨烯纳米复合材料非标记免疫传感器 .21.2 论文研究背景 .22 实验部分 32.1 仪器与试剂 .32.2 凝血酶适体传感器 .32.3 免疫传感器的制备和表征 .52.3.1 免疫传感器的
2、 制备 52.3.2 免疫传感器的电化学测量 63 结果与讨论 63.1 凝血酶适体传感器的特性 .63.2 免疫传感器的特性 .73.2.1 银氧化石墨烯纳米复合材料的特性 73.2.2 电化学免疫传感器的特性 73.2.3 孵育时间优化 83.2.4 免疫传感器的 循环伏安响应和校准曲线 93.2.5 免疫传感器的选择性、再现性和稳定性 104 结论 10参考文 献 111基于纳米复合物的适体与免疫传感器的制备与表征李康西南大学化学化工学院, 重庆, 400715摘要：本文主要报道了基于氧化石墨烯与 Hemin 以及纳米 Ag 形成的纳米复合物的凝血酶适体传感器以及非标记免疫传感器。通过对
3、各项实验条件的优化，制备的以银-氧化石墨烯复合物修饰的非标记免疫传感器能较好地利用于甲胎蛋白（AFP）的电化学检测。该传感器具有较为快速灵敏和检测范围较宽的特点。关键词：适体传感器；免疫传感器；纳米复合材料；甲胎蛋白The preparation and characterization of aptamer and immunosensor based on nanocompositesLI KangSchool of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest China University, Chongqing 400715, China
4、Abstract: In this paper, thrombin aptasensor and label-free immunosensor based on hemin-graphene oxide and silver- graphene oxide, respectively, was reported. Under the optimal detection condition, label-free immunosensor based on silver- graphene oxide was more suitable for electrochemical determin
5、ation of -1-fetoprotein (AFP). The proposed sensor exhibited unique properties such as a rapid speed and wide linear range when used to detect AFP.Keywords: aptasensor; immunosensor; nanocomposite; -1-fetoprotein 1 引言适体（aptamer ）是用配体指数富集法系统演化（SELEX ）技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核
6、苷酸序列。通过 SELEX 技术筛选得到的适体不仅具有类似抗体对目标分子高亲和力和高特异性，分子量小、结构简单、易合成和可进行连接性修饰等优点，而且具有反应速度快、可反复使用和长期保存等优点 1。与抗体相比，适体作为生物传感器的敏感元件具有一定的优势，适体的出现为生物分析方法和传感器的设计开辟了新思路 2。电化学传感器具有选择性好、灵敏度高、响应时间快、操作简单、价格低廉等等许多优点，再与适体的高特2异性和选择性结合后，受到了研究者的广泛关注 3。国内外有很多人员和小组都在此领域展开了创新性的工作 4。适体电化学传感器根据是否标记可分为标记型和非标记型，都是通过检测电极表面电活性识别元素的电信
7、号达到识别和鉴定靶物质的目的。免疫传感器是基于抗体和抗原能够发生特异性结合形成稳定的免疫复合物，并将特异性免疫反应与高灵敏的传感技术结合起来，用以检测抗体和抗原反应的生物传感器。目前的研究领域广泛存在于临床诊断，环境分析，药物分析和食品安全等诸多方面，免疫传感器相对于其他分析仪器具有分析速度快、灵敏度高、选择性高、操作简便与成本低廉的优点，具有很广阔的发展前景。由于产生的信号不同，免疫传感器可分为质量检测免疫传感器、热量检测免疫传感器、光学免疫传感器和电化学免疫传感器 4 种类型。电化学免疫传感器是免疫传感器中研究得最多、最早并且最成熟的一个种类，具有选择性好、灵敏度高、检测速度快，成本低等优
8、点。我们通过循环伏安实验测定实验中不同时间点的峰电流值来检测待测物的量。根据检测信号的产生来源是否自来标记物，电化学免疫传感器又可以分为无标记型（直接测定）和标记型（间接测定）两种类型 5。1.1 基于新颖的氧化石墨烯纳米复合材料非标记免疫传感器石墨烯是一个二维碳板，由于它的内在特性已成为材料科学领域一颗璀璨的新星，如高导电性、表面积大、机械强度大和良好的生物相容性。基于这些优点，石墨烯纳米复合材料极大地吸引了研究人员的注意力，因此，近些年来用于发展电化学生物传感器。然而，在水溶液石墨烯的不可逆聚集限制它的实际应用。氧化石墨烯，一种石墨烯的衍生物，基底平面与边缘含有大量含氧基团，使氧化石墨烯获
9、得了亲水性，形成稳定均匀的氧化石墨烯悬浮液。而且，氧化石墨烯中含氧团体的一部分可以作为对接极性和无机纳米粒子的锚。合起来，氧化石墨烯是石墨烯复合材料最好的基底。近些年，又由于用不同的纳米粒子填装氧化石墨烯纳米片的研究有很大进展，比如三氧化二铁、铅、氧化锌和金等等。其中，存储在氧化石墨烯上纳米片的金属纳米粒子由于良好的电导率和化学稳定性吸引了研究人员的关注。银纳米粒子不仅具有上述优点而且它独特的产品具有较高的催化活性和表面增强拉曼散射。针对这些优异的性能，3银纳米粒子被广泛应用于电化学传感器和生物传感器等 6。1.2 论文研究背景在这个人民生活水平日益增长的年代，健康已成为一个不容忽视的社会问题
10、。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血。用于外伤、手术、口腔、耳鼻喉、泌尿、烧伤、骨科、等出血的止血。凝血酶能使纤维蛋白原转化成纤维蛋白。局部应用后作用于病灶表面的血液很快形成稳定的凝血块，用于控制毛细血管、静脉出血，或作为皮肤、组织移植物的黏合、固定剂。当药品中凝血酶的含量在标示量的 80%以上时，才是有效的，因此测定凝血酶的含量是很关键的。可将凝血酶与适体传感器结合，通过测定电信号的强度而知凝血酶的含量。肝细胞癌是一个与肝脏有关联的癌症，是世界上癌症死亡最普遍的原因和致命的恶性肿瘤。然而,据报道,AFP 在肝细胞癌患者的血清中含量较高，但是在健康人血清中的含量
11、可相对忽略。所以 AFP 可作为诊断和预测处于早期阶段肝细胞癌的一个指标。基于夹心型免疫传感器的一些策略，如电化学和发光化学免疫分析法，还有酶连接免疫吸附测定，都可应用于 AFP 的测定。但是，二次抗体的制备在这些方法中出现了一些问题，比如说，耗时间、操作复杂和高费用。与上述夹心型免疫传感器相比，非标记免疫传感器，就显得简单，而且容易操作，成本低。尤其是，没有必要合成二次抗体。2 实验部分2.1 仪器与试剂CHI660C 电化学工作站（上海辰华仪器公司），BRANSONIC 200 超声清洗仪( 德国 BRANSON ULTRASCHALL 公司)，CS 501-SP 型超级数显恒温器(重庆四
12、达实验仪器厂) ，三电极体系。凝血酶、氯铂酸、氯金酸均购于 Sigma 公司(美国 )，氨基凝血酶适体互补链，氨基凝血酶适体链，HRP，氨基化二氧化硅，Hemin，PBS 缓冲液(NaCl 137 mmolL1 ，KCl 2.7 mmolL1 ，Na 2HPO4 10 mmolL1 ，KH 2PO4 2 mmolL1 )，0.5%戊二醛、葡萄糖，牛血清蛋白（96-99 %），硝酸银，氧化石墨烯，磷酸盐缓冲液。实验用水均为二次去离子水。2.2 凝血酶适体传感器4首先合成二次抗体，取 0.8 mL 氨基化二氧化硅，离心取下层，加入pH=7.0 的 PBS 缓冲液稀释至 1 mL，加入 500 L
13、0.5%戊二醛离心搅拌 20 min后取其下层，用 1 mL PBS 洗涤一次后取下层用 1 mL PBS 缓冲液稀释，去 0.5 mL 溶液加入 10 L 100 M氨基凝血酶适体链，其余保持放置于冰箱中，将混合物离心搅拌 20 min 后倾去多余的戊二醛，滴入少量 PBS 缓冲液分散，即可得到所需的二次抗体。凝血酶适体传感器的构建过程如图 1 所示，先用 0.05 的氧化铝粉末打磨裸金电极，在放置超声仪中清洗，清洗完毕后取出晾干待用。首先，在预处理好的裸金电极表面滴 6 L Hemin/GO，然后晾干形成 Hemin/GO修饰的金电极。再将该电极插入浓度为 2 ngmL-1 的铂金酸溶液中
14、，在电压为-0.2 V 的条件下进行电沉积，电极表面得到一层纳米铂膜。接着，将 20 L氨基凝血酶适体互补链 AptamerI 通过巯基与 Pt 的作用固载到电极表面，室温下放置 16 h 得到 AptamerI/Pt/Hemin/GO 修饰的金电极。然后 AptamerII(20 L) 通过与 AptamerI 的碱基互补配对被组装到电极表面，之后用 10 L 2 mgmL-1 HRP滴涂于电极表面进行封闭，冰箱放置 6 h，即制得目标适体传感器。电极在不使用时放于 4 的冰箱中保存。图 1 凝血酶适体传感器的组装过程示意图Fig. 1 The assembling process of t
15、hrombin aptasensor5循环伏安法是测定修饰电极性质的一种常用的有效方法，实验测量以目标电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极。本文中的循环伏安实验是在室温下 pH=7.0 的 0.1 molmL-1 PBS 缓冲液里，-0.60 V （对饱和甘汞电极）电位区间，扫速为 0.1 Vs-1 条件下进行的。如图 2 所示，Hemin/GO 修饰的金电极展现出一对明显的氧化还原峰(曲线 B), Pt 层的形成使得峰电流突然变大(曲线 C)，而当 AptamerI、AptamerII 相继被组装到电极上时，峰电流逐步减小( 曲线 D、曲线 E)，此外封闭剂 HRP 的
16、作用使得峰电流几乎没有变化( 曲线 F)，这说明两条适体链靠非特异性吸附作用而结合在一起的可能性很小，最后，当目标适体传感器孵育 0.5 nmolL-1 凝血酶之后，峰电流反而下降了(曲线 G)。这种测定方法是根据适体链与靶物质结合前后改变了电子传输阻碍力的大小，进而引起电流值的变化来对靶物质进行定量分析的，因为当靶物质与适体链的结合使得适体链从电极表面脱落下来，减小了电子传输过程中的阻力，进而使电流值增加。当传感器在靶物质中放置一段时间过后，其峰电流值将增大，且变化值会随着靶物质浓度的增加而增大。-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10.-15-10-5005010curent/A
17、potential/VBCDEFG图 2 凝血酶适体传感器表征曲线Fig. 2 CVs of modified thrombin aptasensor2.3 免疫传感器的制备和表征 2.3.1 免疫传感器的制备在氧化石墨烯基质上原位还原二铵合银离子制得了银-氧化石墨烯纳米复合6物。将 0.5 g 葡萄糖加人到 10 mL 1 mgmL-1 氧化石墨烯中温和搅拌分散。然后，将氨水和氢氧化银合成的新鲜的氢氧化二氨合银溶液混合加入到上述溶液中。搅拌几分钟后，混合溶液持续静置 1.5 h。最后，离心、洗涤净化合成的悬浮液。合成的银-氧化石墨烯纳米复合物分散在 0.4 %萘酚的酒精溶液中。用 0.3 和
18、 0.05 m 的氧化铝粉末依次磨光 4 mm 的金电极，然后，在乙醇和双重蒸馏水中先后用超声波洗涤，作为化学修饰电极，裸露的金电极使用前在空气中晾干。首先，将分散在萘酚酒精溶液中的银-氧化石墨烯悬浮液取出 4 L滴入到裸的金电极表面以形成银- 氧化石墨烯修饰的金电极。其次，为了有效地捕获抗体，将上述修饰电极浸入 2 mL 1 %的氯金酸中-0.2 V 恒电势沉积 15 s，则金纳米粒子被装载到银-氧化石墨烯修饰的电极上，同时金纳米粒子还可防止氧化还原活性物质泄漏。随后，金纳米粒子/银 -氧化石墨烯修饰的电极层沉浸在 AFP 抗体溶液中 12 h，保持 4 C。最后，0.25 wt.% BSA
19、 作为封闭剂，在 30 min 内消除非特异性结合。免疫传感器的制备过程示意图见图 3。图 3 免疫传感器的组装过程Fig. 3 The assembling process of immunosensor2.3.2 免疫传感器的电化学测量通过三电极体系的 CHI 660C 电化学工作站进行电化学测量，以饱和甘汞电极作对比从-0.08 V 到 0.26 V 以 50 mVs-1 的速率在 pH=7.4 的磷酸盐缓冲中进行电位扫描，直到得到一个稳定的信号。所有的电极测试实验都在室温下进行。3 结果与讨论3.1 凝血酶适体传感器的特性7图 2 展示了凝血酶适体传感器逐步修饰的 CV 曲线图，在电极
20、上沉积铂之后，曲线上出现了一个明显的氧化还原电流峰，但在之后的每次修饰后峰电流值会减小，直到孵育凝血酶之后，峰电流值会再次增大，说明凝血酶适体传感器对凝血酶的识别使峰电流值增强。3.2 免疫传感器的特性3.2.1 银氧化石墨烯纳米复合材料的特性对氧化石墨烯和银-氧化石墨烯纳米复合物做紫外可见光谱分析。氧化石墨烯在波长 300 800 nm 范围内没有特征吸收峰。相反，银 -氧化石墨烯纳米复合物在紫外吸收光谱中 410 nm 波长附近有一个独特的吸收峰，说明吸收峰是由于银纳米粒子的存在而形成的。此外，采用电镜扫描对氧化石墨烯纳米片上银纳米粒子的存在和形态进行了深入研究，结果表明氧化石墨烯纳米片看
21、起来就像是一个起皱的薄海绵。有大量银纳米粒子作为球形粒子装饰在氧化石墨烯纳米片上。3.2.2 电化学免疫传感器的特性图 4 展示了逐步修饰电极的循环伏安图。如图 4 所示，由于缺少氧化-还原探针，裸露的金电极上没有探测信号，在裸金电极上使用银-氧化石墨烯纳米材料，一对清楚的氧化还原峰（曲线 B）出现在循环伏安图中。这样的结果归因于银- 氧化石墨烯纳米复合物作为一个氧化还原探针的参与。当金纳米粒子分散在银- 氧化石墨烯修饰的电极上之后，一对峰值电流（曲线 C）显著增加。这是因为金纳米粒子不仅提供大的表面积，而且还拥有高的导电性进而加速电子转移。AFP 抗体和 BSA 被连续地固定在金纳米粒子银-
22、氧化石墨烯修饰的金电极上之后，均出现了降低信号（曲线 D 和 E）。结果表明, AFP 抗体和 BSA 作为蛋白质生物大分子在电子转移过程中具有阻碍电子传输的能力。此外，孵育5 ngmL-1 AFP 抗原之后又获得一个降低信号（曲线 F），说明抗体成功地识别并结合了抗原。8-0.10. 0.10.20.3-20-100102030 Curent /APotential /VABFEDC图 4 电化学免疫传感器电极修饰图Fig. 4 CVs of modified electrochemical immunosensor此外，循环伏安实验在 0.1 M PBS (pH=7.4)缓冲液中以不同的扫
23、描速率进行测定，从图 5 我们可以知道，扫速在 20-250 mVs-1 之间的阳极峰流值会有一个线性关系，阴极峰流值同样如此。501015020250501015020250curent/Arate(mV/s)I =0.91v +23.548 R .986图 5 免疫传感器在 0.1 M PBS (pH =7.4)缓冲液中扫速与阳极峰电流值的线性图Fig. 5 The linear figure of different scan rate and the anode peak current in 0.1 M PBS (pH =7.4)3.2.3 孵育时间优化9免疫反应时间很大程度上影响了
24、免疫传感器的灵敏度，因此优化孵育时间具有重要意义。实验如下：裸金电极按前面所描述的那样逐步被修饰，于 5 ngmL-1 AFP 溶液中孵育不同的时间，记录不同时间点下的循环伏安曲线。如图 6 所示，随孵育时间的增加，峰值电流逐渐减小直到 20 min 后出现一个平台，标志着达0510152025305607080901010curent/Atime/in图 6 免疫传感器在 AFP 中孵育时间的优化Fig. 6 Optimization of incubation time for the immunosensor in 5 ngmL-1 AFP到了饱和状态。因此，20 min 被确定为最佳孵
25、育时间。3.2.4 免疫传感器的循环伏安响应和校准曲线在最优测定条件下，免疫传感器用于测量不同浓度的 AFP。如图 7 所示，由于电子迁移过程阻碍的增加，阳极峰电流值随着 AFP 浓度的增加而减小。因此，电信号的变化可以作为测定 AFP 含量的一个指标，其校准曲线绘制在图 7 中，在 3 pgmL-1 检出限下阳极峰电流值与 AFP 浓度的对数成线性关系，AFP 的浓度范围为 0.01 ngmL-1 到 100 ngmL-1。相应的回归方程为 y26.0761x 58.035，相关系数为 0.9894。10-2-10122040608010curent/Alog(c)/(ng/mL)I= -2
26、6.07logc +58.035 R=.984图 7 不同浓度 AFP 与阳极峰电流值的线性图Fig. 7 Calibration plot for the immunosensor in various AFP concentrations3.2.5 免疫传感器的选择性、再现性和稳定性我们选择了 3 种潜在的干扰物质对免疫传感器的选择性进行了研究，分别是 20 ngmL-1 BSA、20 ngmL-1 CEA、20 ngmL-1 半胱氨酸。结果表明，当我们与仅有 5 ngmL-1 AFP 存在下的结果相比，每一种干扰物质的电化学响应可以被忽略。除此之外，三种干扰物质与 AFP 混合物的电化学
27、响应几乎与单独的AFP 是一样的。基于抗原抗体的特异性免疫反应的目标传感器，在 AFP 测定中具有良好的选择性。用 5 个准备好的免疫传感器在相同浓度的 AFP 中测定免疫传感器的再现性。结果表明，5 个免疫传感器的电化学响应具有相似性，其相对标准偏差为 3.7 %，达到了很好的再现性。为了检测免疫传感器的稳定性，用相同的免疫传感器在 PBS 缓冲液进行 50个周期连续的循环伏安实验测量，得到的相对标准偏差是 4.28 %。当免疫传感器存储在 4 C 温度下，七天之后再次测量没有明显的变化。4 结论本实验中免疫传感器使用的银-氧化石墨烯纳米复合物是在氢氧化二氨合银溶液中原位还原合成的，它不仅具
28、有了良好的分散性和生物相容性，而且还有很好的氧化还原电化学活性。因此，我们通过使用活性氧化还原银-氧化石墨烯纳米复合物作为探针和平台得到了一个新颖的非标记 AFP 检测免疫传感器。实验表明，将纳米技术应用于免疫传感器可以大大提高传感器的性能，具有一定11的实用价值。参考文献:1 漆红兰，李延，李晓霞，张成孝.适体传感器研究新进展J.化学传感器，2007,27（3）:1-6.2 黄田贞，林馨馨，陈媛媛，官双燕.核酸适体电化学传感器研究的新进展J.化学传感器，2010,30（1）:4-7.3 Privett B.J., Shin J.H., Schoensch M.H. Anal. Chem. 2
29、010, 82: 4723-4741.4 Willner I., Zayats M. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46: 6408- 6418.5 雷丽红，傅迎春，徐霞红，谢青季，等.基于核酸适体的电化学生物传感器J.化学进展，2009， （21）4:724-726.6 刘艳，牛卫芬.纳米金在电化学免疫传感器中的应用J.长江大学学报（自然科学版） ，2010， （7）3:460-462.12致谢首先我要衷心地感谢我的指导老师许文菊教授！在做论文期间，许老师严谨细致、一丝不苟的治学态度一直是我学习的榜样；她明锐的科研思维和循循善诱的教导给予了我无限的启迪，经过这些过程
30、，我对今后将要学习和从事的事业方向也有了相当程度的了解。正是在老师这段时间的关心和帮助下，让我在完成了本科化学学习的基础课程后，有一个理论与实际结合的研究机会，以检验自己大学四年的理论收获。在此，我谨向许老师致以诚挚的谢意！感谢伍永梅、袁亚利、冯晓辉师姐以及实验室其他师兄师姐对我的帮助和鼓励，让我很快地适应科研生活。伍咏梅和袁亚丽师姐在我进入实验室之后给予了很多理论和实践上的指导帮助，她们精益求精，锲而不舍的实验态度让我深受感染，没有她们的无私的帮助，我的毕业论文不可能这么顺利地完成。四年的大学学习中,感谢各任课教师对我的帮助和指导,他们平时对我的悉心教导对我这次能完成论文起着很大的作用。还有，感谢我的辅导员陈争妍老师，正是老师们一直以来对我们的言传身教，才使我们健康、迅速地成长，在这里向他们表示感谢。另外，我还要感谢同寝室一起做毕业论文的同学们，大家在一起互相帮助，共同进步，形成了一个非常团结的集体。最后,向所有关心和帮助过我的老师、同学和朋友们表示最诚挚的谢意！
