1、1,大赛璐（中国）手性事业部,奚文伟,手性分析中的注意事项,手性分析条件的建立和优化,2,内容提纲,1. 手性HPLC分析条件的建立和优化1-1 正相色谱2-2 反相色谱2. 手性色谱柱的自动筛选3. 手性分析中的注意事项,3,Daicel手性色谱柱一览表,正相直链淀粉衍生物CHIRALPAK AD / AD-HCHIRALPAK AS / AS-H纤维素衍生物CHIRALCEL OD / OD-HCHIRALCEL OJ / OJ -HCHIRALCEL OA, OB, OCCHIRALCEL OF, OG, OKCHIRALCEL CA-1,反相CHIRALPAK AD -RHCHIRAL
2、PAK AS -RHCHIRALCEL OD-RHCHIRALCEL OJ -RH,其它CROWNPAK CR (), ()CHIRALPAK OT(), OP ()CHIRALPAK WH, MA ()CHIRALPAK QD-AXCHIRALPAK QN-AX,共价键合型新产品CHIRALPAK IACHIRALPAK IB,4,分析条件优化流程图 (1),酸性,中性,碱性,1. 流动相中添加物的必要性,配制流动相,Hex/IPA/TFA =90/10/0.1,Hex/IPA/DEA =90/10/0.1,Hex/IPA =90/10,样品,5,碱性样品,添加物在分离中的作用,Hex/IP
3、A/DEA=90/10/0.1,流量：1.0mi/min. 温度：25、检测波长：（254）,流动相 Hex/IPA=90/10,Hex/IPA/AcOH=90/10/0.1,流动相 Hex/IPA=90/10,流量：1.0mi/min.温度：40、检测波长：（254）,酸性样品,（没出峰 ),（无法分离 ),6,添加物的种类和用量,*1 主要用于1级胺 *2 主要用于1级氨基醇,7,分析条件优化流程图 (2),保留时间?,长,适宜的分析时间 (10-30 min.),短,增加 异丙醇,增加 正已烷,2. 配制好流动相,选择合适的手性柱,分析,8,分析条件优化流程图 （3）,没有分离,部分分离
4、,3. 选择合适的手性柱,尝试别的手性柱,OK!,基线分离,继续优化分析条件,分离？,9,筛选结果,色谱条件流动相： Hex./IPA/ AcOH =90/10/0.1 流量 ：1.0ml/min. 温度 ：40 检测波长 ：UV254nm 样品 ：,先择效果最好的手性柱, 然后继续优化分析条件,10,分析条件优化流程图 （4-A）,部分分离,A.降低异丙醇浓度,B. 调整温度,C. 更换醇类,4.分析条件继续优化,11,醇浓度的影响,在多数情况下，降低醇的浓度可延长保持时间，改善分离度,Column：AD, Temp.：40, Flow rate：1.0ml/min.,Hex./IPA/ A
5、cOH =90/10/0.1,Hex./IPA/ AcOH =100/1/0.1,Sample：Flurbiprofen,12,部分分离,B. 调整温度,C. 更换醇类,4.分析条件继续优化,分析条件优化流程图 （4-B）,A.降低异丙醇浓度,13,温度的影响,Column：CHIRALPAK AD Mobile phase： Hex./IPA/ AcOH =90/10/0.1, Flow rate：1.0ml/min.,25,40,Temp.： 5,降低柱温会使峰形变宽，但可增大值 升高柱温会使峰形锋利，但值却变小,14,部分分离,C.更换醇类,B. 调整温度,4.分析条件继续优化,A.降低
6、异丙醇浓度,分析条件优化流程图 （4-C）,15,醇种类的影响,Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1,IPA和EtOH有时会使峰形和值发生明显变化,Column：CHIRALPAK AD Temp.：40, Flow rate：1.0ml/min.,Sample：Flurbiprofen,Hex./EtOH/AcOH=95/5/0.1,16,正相柱分析条件优化的总结,根据样品性质判断是否需要往流动相中加添加物 调整正己烷/醇的比例，从而选择适当的保留时间 其它优化方法 流动相的醇浓度 降低醇的浓度虽改善分离度，但会延长分析时间 色谱柱温度 升高柱温虽可使峰形锋利，但值会降低 流动相中
7、醇的种类 改换醇的种类(IPAEtOH)，有时可使分离发生一些变化,17,1. 手性色谱柱分析条件的建立和优化2-1 正相色谱2-2 反相色谱手性色谱柱的自动筛选3. 手性分析中的有关注意事项,内容提纲,18,RH系列（反相用）的规格,*1 有机溶液：醇（甲醇，乙醇，异丙醇）或乙腈 *2 pH7使用时，温度在525 *3 pH超过8时，使用硼酸缓冲液,19,根据样品性质选择流动相,20,反相流动相的pH值对分离度的影响(AS-RH),水溶液,水溶液/CH3CN=60/40 流速：1.0ml/min.,水溶液/CH3CN=60/40 流速：1.0ml/min.,水溶液/CH3CN=80/20 流
8、速：0.5ml/min.,0,5,10,15,mV,0,2,4,6,8,10,12,14,Minutes,7.16,8.77,水,磷酸水溶液 (pH2),硼酸缓冲液 (pH9),0,5,10,15,20,mV,0.0,2.0,4.0,6.0,8.0,Minutes,4.17,4.69,0.0,2.0,4.0,6.0,8.0,0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,Minutes,30.74,36.78,21,有机溶剂种类对分离的影响,水/乙腈 =50/50,水/乙醇 =35/65,水/甲醇 =25/75,2-Methyl-1-tetralone,2-Pheny
9、l-2-butanol,手性柱：CHIRALPAK AD-RH 、流速：0.5ml/min、温度：25,22,反相柱分析条件优化的总结,根据样品性质选择流动相 中性，酸性样品对4种反相柱可使用相同的流动相。但是，碱性样品对OD-RH、OJ-RH组和AD-RH、AS-RH使用的流动相是不同的。 探索适当的保留时间和流动相组成 其它优化条件 水溶液和有机溶液比例 多数情况下降低有机溶液的浓度可改善分离性能，但将延长分析时间。 色谱柱温度 升高色谱柱温度会使峰形变得锋利，但会降低值。 有机溶剂的种类 有机溶剂的种类不同，其洗脱强度也不同。有时其分离效果也发生一些变化,23,内容提纲,1. 手性色谱柱
10、分析条件的建立和优化2-1 正相色谱2-2 反相色谱2. 手性色谱柱的自动筛选3. 手性分析中的注意事项,24,手性色谱柱组合筛选,手性色谱柱组合CHIRALPAK AD-H CHIRALPAK AS-H CHIRALCEL OD-HCHIRALCEL OJ -H 手性色谱柱尺寸：0.46cmI.D.15cmL,25,为何选用AD-H,AS-H,OD-H,OJ-H这4种柱子？,年 客户样品分析 个样品的分析结果,达到基线分离的手性柱比例：,基线分离 79% （524）,部分分离 10% （63）,不分离 11% （73）,AD系列、OD系列、 AS系列、OJ系列 92% （482样品）,其他
11、8% （42样品）,26,手性柱 ：AD-H(25cmL)流动相 ：Hex/IPA=9/1流速 ：1.0mL/min.温度 ：25UV波长 ：254nm,标准条件,手性柱 ：AD-H(15cmL)流动相 ：Hex/IPA=9/1流速 ：3.0mL/min.温度 ：25UV波长 ：254nm,筛选条件,柱长（ 1525）流速（13）分析时间短缩为（15）,为何选用15cm长度手性色谱柱呢？,27,组合筛选设备,IPA,28,泵,检测器,色谱柱自动切换阀,流动相,自动进样器,组合筛选设备示意图,29,1.用UV检测器只出现“峰”的时候 应用旋光检测器可确认其分离状况,2. 可确认其洗脱顺序,串联旋
12、光检测器的好处,30,组合筛选设备的程序编制,约6小时可获得16条件的色谱图 1色谱图平均约20分钟,31,筛选结果示例,样品：,32,信息: 判别具有分离可能性的色谱柱,33,信息2: 色谱柱和洗脱顺序,AD-H vs OD-H、OJ-H的洗脱顺序相反,34,信息3: 醇的种类对分离的影响,OD-H和OJ-H，用每种流动相均可分离。 AD-H，只有用乙醇才可分离。,35,分析条件的选择,选择条件的要点 洗脱时间 峰形 对映体的洗脱顺序,36,样品制备时,选择条件的要点 样品的溶解度 洗脱顺序,37,若筛选没得到理想的分析条件时,选择最接近基线分离的条件 调整流动相中醇的比例 调整流速 调整温
13、度 变更为同种类长度为25cm的色谱柱。 尝试其他的色谱柱,38,应用组合筛选设备探索分析条件总结,使用具有广普分离能力的的4种手性色谱柱使用适合高流速的15cm的手性色谱柱组合应用2种醇，考察其分离情况和旋光检测器并用，可一次性获得更多的判断信息,39,内容提纲,1. 手性HPLC分析条件的建立和优化2-1 正相色谱2-2 反相色谱2. 手性色谱柱的自动筛选3. 手性分析中的注意事项,40,Daicel大部分手性柱是涂敷型产品，在市场上具有着独特性。若导入错误的溶剂，涂敷型柱子便会马上被破坏掉。当导入错误的溶剂时，柱压会出现明显上升。当用户出现柱压剧增或分离突然变差时，最常见的原因是错误地使
14、用了溶剂。一旦错误地使用了溶剂，重新恢复柱子性能的可能性很低。若您遇到此类分析故障时，请对出厂报告重新确认柱子的性能或与大赛璐联系,最常见的使用故障=溶剂错误,41,将手性柱接入液相色谱仪之前,1.用异丙醇将HPLC所有管路彻底清洗。 2.用流动相将HPLC所有管路彻底清洗。,所有溶剂入口,泵,泵与进样阀之间,定量环,进样阀清洗液,进样阀与柱子之间,柱子与检测器之间,检测器,使用前彻底清洗管路,42,流动相或样品溶液过滤不彻底，固体颗粒堵塞管路或柱头，会引起柱压过高。样品中成分在柱头析出或强烈吸附，会引起柱压升高。流速过快，会引起柱压升高,每种柱子有特定的承压范围，请仔细参照相应的色谱柱说明书
15、。 彻底过滤流动相及样品溶液。 样品预处理 使用保护柱 合理调节流速，特别在把柱子刚接上仪器的时候,原因：,后果：,长期超压会引起柱头塌陷，反压上升，柱效下降。,方法：,压力,43,mg/L,mg/L,流动相中水含量的影响,44,mg/L,流动相中水含量的影响,45,CHIRALCEL OJ 正己烷/乙醇90/10 1.0 ml/min，275 nm,10 25 40 ,峰变形 (消旋化),46,1,添加物残留效应,47,残留物在普通流动相中可长时间地稳定保留 用醇洗涤可除去大部分的碱性添加剂 用酸洗涤也可除去碱性残留物 用碱洗涤可除去酸性残留物建议使用专用的酸性条件和碱性条件的手性柱 在分析酸性和碱性样品时，勿忘使用添加剂,如何避免“残留效应”,48,谢谢！,
