两种方法测定丹参滴注液糖类含量_陈农.pdf

1、相似的色谱峰样品 ， 经毛细管电泳对阿托品拆分实验 ，验证产品中含有大量阿托品 ， 根据色谱峰检出情况 ， 推测为阿托品勾兑品 。特征图谱中的色谱峰经成分分离和结构鉴定 ， 指认了 4 个色谱峰 ， 1 号峰为山奈酚 -3-O-半乳糖 -( 61)鼠李糖 -7-O-葡萄糖苷 ， 2 号峰为山奈酚 -3-O-葡萄糖 -( 61) 鼠李糖 -7-O-葡萄糖苷 ， 3 号峰为东莨菪内酯 ， 4号峰为芦丁 。参考文献 1 国家药典委员会 中华人民共和国药典 ( 一部 ) M 北京 : 中国医药科技出版社 ， 2010 2 国家药典委员会 中华人民共和国药典 ( 二部 ) M 北京 : 中国医药科技出版

2、社 ， 2010 3 张楠 ， 郭新红 ， 张振中 RP-HPLC 测定颠茄片中 3 种主要成分含量 J 医药论坛杂志 ， 2005， 26( 19) : 1922 4 韩忠刚 ， 冯华 ， 罗秀琼 HPLC 色谱法测定颠茄浸膏片中硫酸阿托品的含量 J 中医药导报 ， 2008， 14( 9) : 7883 5 王全华 ， 张新枝 ， 张春夏 颠茄流浸膏含量测定方法改进 J 中国药品标准 ， 2006， 7( 3) : 1112 6 杨志明 ， 汪芸 ， 张小军 毛细管电泳 -电致化学发光法测定维 U 颠茄铝胶囊中硫酸阿托品的含量 J 药物分析杂志 ， 2008， 28( 7) : 10421

3、045 7 孔泉 ， 石国明 ， 李志红 ， 等 高效液相色谱法测定颠茄草中硫酸阿托品含量 J 中国药业 ， 2011， 20( 19) : 38DOI 103870/yydb201305039两种方法测定丹参滴注液糖类含量*陈农 ， 丁宁 ， 彭国平 ， 李贺敏 ， 郑云枫 ， 李存玉 ， 李红阳( 南京中医药大学药学院 ， 210029)摘 要 目的 分别采用高效液相色谱法 ( HPLC 法 ) 和紫外分光光度法 ( UV 法 ) 测定丹参滴注液中糖类成分 ， 建立丹参滴注液中糖类成分的质量控制方法 。方法 同时建立结合示差折光检测器的 HPLC 法 ( HPLC-RID) 法和蒽酮 -硫

4、酸比色法 ， 测定 3 批丹参滴注液中糖类成分含量 。结果 HPLC 法在葡萄糖浓度为 231 17 84 mg mL1范围内呈良好的线性 关 系 ， 样品加标平均回收率 100 1%， RSD 为 1 69%。蒽 酮 -硫酸比色法在葡萄糖浓度 0 019 50097 5 mg mL1范围内呈良好的线性关系 ， 样品加标平均回收率 100 05%， RSD 为 1 16%。3 批制剂中葡萄糖含量分别为 1199， 1268， 1197 g， 总糖含量分别为 1396， 1461， 13 73 g。结论 HPLC 法和 UV 法测定丹参滴注液中糖类成分均方便 ， 灵敏 ， 准确 ， 二者结合能为

5、丹参滴注液中糖类成分的质量控制提供技术支持 。关键词 丹参滴注液 ; 葡萄糖 ; 糖类成分 ; 色谱法 ， 高效液相 ; 紫外分光光度法中图分类号 R286; R9271 文献标识码 A 文章编号 10040781( 2013) 05067203丹参滴注液是水溶性丹参制剂 ， 具有活血化瘀 、理气开窍 、扩张血管和增加冠状动脉血流量作用 ， 临床主要用于心绞痛 、心肌梗死等疾病的预防和治疗 ， 其主要活性成分为水溶性酚酸类物质 1。目前已对其中所含各组分进行了深入研究 ， 并证明其为丹参治疗心血管疾病的主要药效物质基础 。其制剂中的糖类物质虽未发现有生物活性 ， 但对血浆渗透压有较大影响 。收

6、稿日期 20121005修回日期 20121120基金项目*康缘中医药科技创新基金 ( HZ1006KY) ; 南京中医药大学中药学一级学科开放课题资助 ( 2011ZYX3-008)作者简介 陈农 ( 1987) ，男 ， 江苏南京人 ， 在读硕士 ， 主要从事中药有效成分的筛选及药理活性研究 。E-mail: farmerchen_123 sina com。通讯作者 彭国平 ( 1963) ，男 ， 江苏金坛人 ， 教授 ， 博士 ，主要从事中药化学产物分离与分析 。E-mail: guopingpengsohu com。血浆渗透压的稳定对维持血细胞正常形态和功能十分重要 2。丹参滴注液原

7、标准 3仅采用旋光法测定葡萄糖含量 。由于丹参滴注液中含有有旋光性质的成分 ， 如丹参酚酸类成分 ， 所以旋光法测葡萄糖含量准确性不高 。同时 ， 中华人民共和国药典 2010 年版 4中只有用比色法控制药材或制剂中总糖含量 ， 而没有控制糖类单一成分的方法 。葡萄糖是丹参滴注液中的重要辅料 ， 其投料准确性直接影响制剂安全性 5。因为葡萄糖无生色基团 ， 所以没有紫外吸收 ， 不能采用常用的紫外检测器 。所以 ， 笔者在本实验中建立结合示差折光检测器的高效液相色谱 ( HPLC-RID) 法测定丹参滴注液中葡萄糖含量 ， 并结合紫外分光光度法对总糖含量进行控制 ， 以期更好地控制该制剂中糖类

8、物质 。1 仪器与试药11 仪器 Waters510 泵 ， 示差折光检测器 ( RID-6A，276 Herald of Medicine Vol. 32 No. 5 May 2013SHIMADZU) ， Rheodyne 进样器 ， EC2000 色谱工作站 ，UV-2401 和 UV-752 紫外分光光度仪 ( 上海分析仪器总厂 ) ， AG285 电子天平 ( 瑞士 Mettler Toledo 公司 ) 。12 试药 丹参滴注液 ( 上海华源安徽锦辉制药有限公司提供 ， 规格 : 每瓶 250 mL， 批号 : 10033003，10040705， 10041603) ， D-无水

9、葡萄糖对照品 ( 中国食品药品检定研究 ， 纯度 99 9%， 批号 : 110833-200904，含量测定用 ) ， 甲醇 、乙腈为色谱纯 ( 淮阴汉邦科技有限公司 ) ， 水为亚沸纯化水 ， 其余试剂均为分析纯 。2 方法与结果21 HPLC 法测定丹参滴注液中葡萄糖含量21 1 色谱条件 色谱柱 : HP Amide 柱 ( 4 6 mm250 mm， 5 m) ; 流动相 : 乙腈 -水 -三乙胺 ( 752503) ; 流速 : 1 0 mLmin1; 柱 温 : 30 ; 进 样量 : 20 L。在上述色谱条件下 ， 葡萄糖色谱峰分离度 15， 理论板数 3 000， 满足定量要

10、求 。212 对照品溶液与供试品溶液的制备 精密称取葡萄糖对照品 D-无水 8920 mg， 置 5 mL 量瓶 ， 加水溶解并 稀 释 至 刻 度 ， 摇 匀 ， 即得每毫升含葡萄糖 1784 mg 的对照品溶液 ; 取制剂溶液 ， 精密量取 2mL， 置 10 mL 量瓶 ， 加水稀释至刻度 ， 摇匀 ， 用孔径 022 m 微孔滤膜过滤 ， 取续滤液即得供试品溶液 。213 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液适量 ， 分别稀释 0， 2， 4， 8， 16， 32 倍 ， 精密吸取上述 6 种对照品溶液各 10 L， 注入液相色谱仪 ， 测定峰面积 。以对照品浓度 ( mgmL1) 为

11、横坐标 ( X) ， 其峰面积为纵坐标 ( Y) ， 绘 制 标 准 曲 线 ， 表 明 葡 萄 糖 在 2 311784 mgmL1范围内峰面积与浓度呈良好线性关系 。得回归方程 : Y=22393X( r=0999 9) 。214 精密度实验 取一定浓度的葡萄糖对照品 ， 按“211”项色谱条件 ， 连续进样 6 次 ， 记录峰面积 ， RSD为 161%( n=6) 。215 重复性实验 取同一批 ( 批号 : 10020503) 制剂 ， 按 “212”项下制备供试品溶液 6 份 ， 测定葡萄糖含量 。结果每瓶葡萄糖平均含量为 11 66 g， RSD 为150%( n=6) 。216

12、 稳定性实验 取同一供试品溶液 ， 分别于制备后 0， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 16， 20， 24 h 进样 ， 记录峰面积 ，RSD 为 196%( n=10) ， 表明样品在 24 h 内稳定性良好 。217 加样回收率实验 精密量取同一批号 ( 批号 :10020503) 已知葡萄糖含量的丹参滴注液 1 mL， 共 6份 ， 置于 10 mL 量瓶 ， 分别精密加入适量葡萄糖对照品( 与 1 mL 丹参滴注液中葡萄糖含量相当 ) ， 按 “2 1 2”项制备供试品溶液 ， 进样测定 ， 计算回收率 。结果平均回收率 1001%， RSD 为 169%， 见表 1。表 1

13、 HPLC 法葡萄糖加样回收率实验结果序号样品量 加入量 测得量mg回收率 /%1 46640 3792 84803 100642 46640 3792 85077 101363 46640 4740 92630 97034 46640 4740 94286 100525 46640 5688 101743 96886 46640 5688 106000 104362 1 8 样品的测定 取丹参滴注液 3 批 ( 批号 :10033003， 100040705， 10041603) ， 依法测定 ， 计算得葡萄糖含量分别为 1199， 1268， 1197 g。22 比色法测定丹参滴注液中糖类

14、含量221 对照品溶液的制备 精密称取 D-无水葡萄糖对照品 25 mg， 置 25 mL 量瓶 ， 用纯化水溶解并定容至刻度 ， 摇匀 ， 即得 。222 供试品溶液的处理 制剂溶液的配制 : 精密量取丹参滴注液 10 mL， 置 100 mL 量瓶 ， 加水稀释至刻度 ， 摇匀 ， 精密量取 1 0 mL， 置 10 mL 量瓶 ， 加水稀释至刻度 ， 即得 。阴性溶液的配制 : 以聚酰胺吸附树脂制备酚酸类活性部位 ( 不含糖 ) 的阴性制剂 ， 依制剂溶液法制备阴性溶液 。223 测定波长的选择 取葡萄糖对照品溶液 、供试品溶液 、阴性制剂溶液各 10 mL， 置 10 mL 具塞试管

15、，各加入蒽酮 -硫酸试剂 40 mL( 勿沿壁加 ， 直接加在液面上 ) ， 摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却 ， 各管加毕后 ，一起浸入沸水浴中 ， 管口加塞 ， 待水浴重新沸腾后反应10 min， 取出试管浸入冰水中冷却 ， 室温放置 10 min，于 400 800 nm 波长范围内进行光谱扫描 。结果表明 ， 葡萄糖对照品 、供试品溶液的最大吸收波长为 580 nm， 而阴性在 580 nm 波长处吸光度很小 ， 基本无干扰 ， 故选择测定波长为 580 nm。22 4 线性关系考察 精密量取葡萄糖储备液各 02， 04， 0 6， 0 8， 1 0 mL， 分别置 10 mL 量瓶 ， 加

16、水至刻度 ， 摇匀 。分别精密吸取上述各浓度溶液 1 0mL 置 10 mL 具塞试管中 ， 各加入蒽酮 -硫酸试剂 4 0mL( 勿沿壁加 ， 直接加在液面上 ) ， 摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却 ， 各管加毕后 ， 一起浸入沸水浴中 ， 管口加塞 ， 待水浴重新沸腾后反应 10 min， 取出试管浸入冰水中冷却 ， 室温放置 10 min， 按分光光度法 ( 中华人民共和国药典 2010 年版一部附录 ) ， 在 580 nm 波长处376医药导报 2013 年 5 月第 32 卷第 5 期测定吸光度 。以空白溶液校正 ， 空白溶液操作同上 。结果表明葡萄糖在 0 019 5 0 097 5

17、 mgmL1范围内吸光度 ( Y) 与浓度 ( X) 呈良好线性关系 ， 回归方程为 Y=7750X0038( r=0998) 。2 2 5 精密度和稳定性实验 精 密 吸取 006 mgmL1葡萄糖对照品溶液 1 0 mL， 照标准曲线制备项下方法 ， 在 580 nm 波长处连续测定 6 次 ，吸光度 RSD 为 024%。另取对照品溶液于室温下放置 0， 15， 30， 45， 60， 75， 90 min， 吸光度几乎无变化 ，RSD 为 049%， 表明稳定性良好 。226 重复性实验 精密吸取 6 份同一批号 ( 批号 :10020503) 样品 1 mL， 照标准曲线制备项下的方

18、法 ，在 580 nm 波长处测定吸光度 ， 总糖吸光度 RSD为 216%， 表明该法重复性良好 。227 加样回收率实验 精确吸取同一批丹参滴注液 05 mL 共 9 份 ， 分别加入 01 mgmL1葡萄糖对照品溶液 0 20， 0 20， 0 20， 0 25， 0 25， 0 25， 030， 030， 030 mL， 分别补水至 1 0 mL， 照标准曲线制备项下的方法 ， 在 580 nm 处测定吸光度 ， 计算回收率 。结果平均回收率为 10005%， RSD 为 116%。见表 2。表 2 UV 法葡糖糖加样回收率实验结果序号样品含量 实加标量 实测量mg回收率 /%1 00

19、277 0019 5 0047 2 100002 00277 0019 5 0047 5 101543 00277 0019 5 0047 3 100514 00277 0024 4 0051 9 99185 00277 0024 4 0052 8 102876 00277 0024 4 0052 3 100827 00277 0029 3 0057 3 101028 00277 0029 3 0055 9 96259 00277 0029 3 0056 5 9829228 样品测定 取丹参滴注液 3 批 ， 依法测定 ， 计算得 3 批制剂中总糖含量分别为 13 96， 1461， 1373

20、 g。本实验通过分别测定 3 批丹参滴注液葡萄糖和总糖含量 ， 发现每瓶丹参滴注液总糖含量比葡萄糖含量高约 2 g， 葡萄糖含量在丹参滴注液糖类成分中占85%以上 。3 讨论本实验对色谱条件进行了优选 ， 优选了两种氨基柱 Phecda-NH2 柱 ( 2 5 mm4 6 mm， 5m， 江苏汉邦科技 有 限 公 司 ) 和 HP Amide HPLC 柱 ( 2 5 mm46 mm， 5m， Chrom-matrix Bio-technology CO ，LTD) ， 结果显示 ， 在糖的色谱分析中 HP Amide 色谱柱峰型对称 ， 分离度好 ， 故选用了 HP Amide HPLC 柱

21、 。在此基础上对采用的乙腈 -水 -三乙胺系统进行分析 ，进一步优选了其流动相的比例 ， 考察了乙腈 水 三乙胺不同比例 ( 70300 3， 75250 3， 82180 3) 下的色谱峰分离情况 ， 结果显示 ， 以流动相为 75250 3 的条件下 ， HP Amide HPLC 柱的色谱峰峰形较好 ， 出峰时间适宜 ， 故选用该流动相 。实验结果表明 ， HPLC-RID 法测定丹参滴注液葡萄糖时在限定浓度范围内有较好的线性关系 ， 并且回收率及 RSD 都符合规定 。其测定结果更接近于制剂葡萄糖标示量 ， 由此可知 ， HPLC 法测定该制剂中葡萄糖含量可行 。而利用比色法测定结果比

22、高效液相色谱法测定结果略偏高 。这是因为比色法测定的是制剂中总糖含量 。本实验室研究发现 ， 丹参注射液制剂中仍存在丹参糖类化合物 ， 包括葡萄糖 、果糖和一些寡糖 。这些糖类成分也可以与蒽酮 -硫酸试剂发生显色反应 ，干扰实验结果 。所以 ， 比色法测定是一类成分的含量 ，不能精确到单一成分 。综上所述 ， 本实验中建立的 HPLC 法可用于丹参滴注液中葡萄糖的含量测定 ， 而比色法可用于该制剂中总糖类成分含量测定 。因此 ， 结合两种分析方法 ， 就能从部分和整体两方面更好地对丹参滴注液中糖类成分进行控制 。参考文献 1 常效春 ， 杨振华 ， 韩恩祥 复方丹参注射液临床应用新进展 J 中

23、国综合临床 ， 2004， 20( 8) : 764766 2 胡晓梅 ， 金秀梅 ， 冯亚茹 ， 等 静脉注射 50% 葡萄糖溶液对血渗透压的影响研究 J 中国综合临床 ， 2003， 20( 7) : 626627 3 国家中成药标准汇编 S WS-11117( ZD-1117) 2002 4 国家药典委员会 中华人民共和国药典 ( 二部 ) M 北京 : 中国医药科技出版社 ， 2010: 1689 5 王桂有 ， 董金保 ， 赵自育 ， 等 含丹参葡萄糖注射液中葡萄糖含量测定方法研究 J 现代中药研究与实践 ， 2003， 17( 5) : 4445DOI 103870/yydb201305040476 Herald of Medicine Vol. 32 No. 5 May 2013