1、第49卷第1期 2010年1月 湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences Vo149 No1 Jan，2010 盐田土中中度嗜盐菌Pontibacillus spY32的 分离与鉴定 邹正中王革娇 (农业微生物学国家重点实验室华中农业大学生命科学技术学院，武汉430070) 摘要：从江苏盐城三圩盐田土样中分离到一株中度嗜盐菌Y32并对其进行了系统鉴定。结果表明，综合 该茵形态学、生理学和16S rRNA基因序列等特征，该菌为Pontibacillus属的一个新种，命名为Pon tibaciUus spY32。菌种已送中国典型培养物保藏中心(CcTCC)保藏，保藏号为
2、CCAM 100050。 关键词：盐田土；中度嗜盐茵；16S rRNA基因；Pontibacillus spY32 中图分类号：Q93999 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2010)01004903 Isolation and Characterization of A Moderate Halophilic Bacterium Pontibacillus sp Y32 from Salt Field Soil ZOU Zhengzhong，WANG Ge-jiao (State Key Laboratory of A cultural MicrobiologyCollege
3、of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University Wuhan 430070，China) Abstract：In this study，a moderate halophilic bacterium Y32 was isolated from salt field soil in Sanwei，YanchengBased on morphological，physiological，biochemical and 16S rRNA gene sequence characteristics，strain Y32 wa
4、s classified into the genus Pontibacillus as a novel species，named as Pontibacillus spY32The strain had been collected in China Center for rrype Culture Collection(CCTCC)under the number CCAM 100050 Key words：salt field soil；moderate halophilic bacterium；16S rRNA gene；Pontibacillus spY32 人们一般将盐浓度高于海
5、水盐浓度的环境称 为高盐环境。地球上存在有多种高盐环境。自然条 件下有两种类型的高盐环境一种称为海洋盐水 是由于海水蒸发后形成的：另一种是Athalassoha line盐水主要是和所处地域的地质情况有关如最 初蒸发事件形成的沉淀的溶解或从周围环境中滤 去某种重要的离子所形成的这种盐水最典型的例 子就是死海它是富含Mg2+的沉淀被溶解后形成 的 人工形成的高盐环境主要有盐场和腌制食品如 腌鱼、腊肉等 Ij 这些高盐环境中蕴含着极其丰富的 微生物资源 嗜盐微生物在食品、医药、化妆品、农业、环境 等各个方面有着广泛的应用 对高盐土壤中植物 的生长有间接的促进作用3 对嗜盐微生物资源的 开发与利用一
6、直是国内外微生物学家关注的焦点 但大多集中在对海洋和盐碱湖泊等水环境中极端 嗜盐菌的研究上而关于土壤嗜盐菌的研究则相对 较少。研究发现盐田环境中既有嗜盐微生物。也有 耐盐微生物还有非耐盐微生物这主要是由于土 壤固有的不均质性造成的l 4_ 大量研究表明，盐土环 境中的主要细菌类群为盐单胞菌科、芽孢杆菌科、 微球菌科和假单胞菌科l5_ 中度嗜盐菌是指只能够适应的盐浓度范围为 0435 molL最适生长盐浓度为0520 molL 。 从各种高盐环境中都能分离到好氧的能形成孢子 的革兰氏阳性中度嗜盐杆菌它们广泛分布于 Bacillus、Halobacillus、Gracilibacillus、Vir
7、gibacillus nZobacillus、Lentibacillus和Pontibacillus等属中 7l 收稿日期：200905一l8 基金项目：国家自然科学基金项目(30671140)；教育部博士点基金项目(4010061010)；教育部留学回国人员启动基金项目 作者简介：邹正中(1982一)，男，湖北红安人，在读硕士生，(电话)13554413263(电子信箱)zhe“gzho“铲oul63c0m；通讯作者，王革娇，教授 博士生导师，(电话)O2787281261(电子信箱)gejiaomaiIhzaueducn。 湖 北 农 业 科 学 2010正 其中Pontibacillus
8、属是由Lim等人于2005年发现 并鉴定的目前仅包括两个种P chungwhensi5 BH030062T和P marin BH030004T均分离自韩 国黄海边的盐田土壤7 本实验室在对连云港台北 和盐城三圩盐田土壤嗜盐菌多样性研究过程中发 现了一系列可培养的中度嗜盐菌 本研究对其中 1株中度嗜盐菌Pontibacillus sPY32进行了系统 的分类学鉴定为嗜盐微生物分类及嗜盐微生物资 源的开发与利用提供理论依据 1材料与方法 11 样品采集与菌种分离 土壤样品于2006年3月下旬采集于盐城三圩 盐田取015 cm深度的土壤，土样过2 mm孔径 筛。取1O g装入含有90mL HGM液体
9、培养基的三 角瓶中置37摇床中振荡30 min，进行梯度稀释 后涂布平板置37温箱中培养两周。菌株经多次 划线得到单菌落 分离到的菌种采用甘油冷冻保藏 法保藏 12形态学特征鉴定 分离到的单菌落划线接种于HGMt9固体培养 基上37cI二培养48 h，观察菌落颜色、大小、边缘和表 面隆起等特征。革兰氏染色采用Dussauh的方法_1O。 用扫描电子显微镜观察细胞形态_l1 13生理生化鉴定 参考Meta等 l2的方法，同时利用API 20 NE 试剂条(BIOMIRIEUX公司)进行鉴定，鉴定项目 包括NaC1生长范围，生长pH值范围，糖发酵，氧 化酶过氧化氢酶，硝酸盐还原，产胞外多糖，淀粉、
10、 七叶甙、明胶水解，葡萄糖氧化发酵，产H S，苯丙氨 酸脱氨酶氨基酸脱羧酶，半乳糖苷酶，脲酶，吲哚 试验和抗生素抗性试验等 14 16S rRNA基因序列分析 通过碱裂解法抽提细菌总DNA93 以细菌总 DNA为模板用16S rRNA通用引物27F(5-AGA G1TI GATCMTGCCTCAG一3 )、1492R(5 一GGYTAC C，rrG，rI、ACGACTY一3 )进行PCR扩增菌株16S rRNA基因D3 PCR产物检测纯化后送交北京三博 远志生物有限责任公司测序 测序得到的16S rRNA基因序列通过BLASTN(http：wwwncbinlm nihgovBLAST)与Gen
11、Bank文库中已有序列进行比 较。用Clustal W软件进行同源性分析再用 MEGA 40软件构建系统发育树ll4。 2结果与分析 21 形态学特征鉴定结果 分离的嗜盐菌Y32菌落为圆形，黄色，菌落直 径约15 mm，菌落表面凸起，边缘完整。革兰氏染色 为阳性。扫描电子显微镜观察显示Y32细胞为杆 状，细胞大小为0508 Ixmx1823 m(图1)。 图1 Pontibacillus spY32菌株的扫描电子显微镜照片 22生长和生理生化特征鉴定结果 NaC1生长范围为320( )，最适NaCl 生长范围为510(wv)；生长pH值范围为 60 90。最适生长DH值为70。菌株Y32与Po
12、n tibacillus属两株模式菌株的主要差异列于表1。 表1菌株Y32与PontibaciUus属标准菌株的特征比较 注：“+”为阳性反应，“一”为阴性反应。 第1期 邹正中等：盐田土中中度嗜盐菌Pontibacillus spY32的分离与鉴定 51 Y32菌株不产胞外多糖(EPS)，氧化酶和过氧 化氢酶阳性葡萄糖氧化发酵型为氧化型；能发酵 葡萄糖、山梨糖、海藻糖产酸，不能发酵阿拉伯糖、 果糖、半乳糖、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、 松三糖、棉子糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、木糖产酸； 硝酸盐还原阳性亚硝酸盐还原阴性：半乳糖苷酶 阳性：产H S和吲哚试验阴性；能水解淀粉和明胶， 但不能
13、水解干酪素、尿素和酪氨酸；精氨酸双水解 酶、苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶阴性； 对链霉素、卡那霉素、妥布霉素、多粘菌素B和萘啶 酸有抗性，对氨苄青霉素、头孢噻肟、棒酸、甲氧苄 胺嘧啶、呋喃妥因、头孢西丁、红霉素、氯霉素、亚胺 培南和阿莫西林敏感 23 16S rRNA基因序列分析 利用PCR扩增到1 429 bp大小的16S rRNA 基因序列NCBI GenBank基因注册号为 EF533969通过与NCBI数据库中已有基因序列比 较发现菌株Y32与Pontibacillus属同源性最高与 已发表的两个Pontibacillus属模式种 marinus BH030004T、P chu
14、n,whensis BH030062T同源性分 别为976、968。而与芽胞杆菌科其他模式种的 同源性较低最高的为ThalassobacillMs属的惟一种 Thalassobacillus deVOFOS G191 同源性为930 选取芽胞杆菌科有代表性的种构建的Y32菌株的 系统发育树见图2 图2邻接法构建的PontibacUlus spY32菌株16S rRNA 基因序列进化树 3讨论 嗜盐微生物系统分类学一直是嗜盐微生物研 究的热点与重点是极端环境下微生物资源开发与 利用的基础。每年被IJSEM接收并承认的微生物新 种中有很大一部分都是在极端环境下分离得到的 过去发现的嗜盐微生物主要是
15、极端嗜盐的现代分 类学将其归类于古菌域、而极端环境中的细菌长期 被人所忽视。在嗜盐细菌中，最主要的类群为好氧 的革兰氏阴性的盐单胞菌科。相对而言分离得到 的好氧的革兰氏阳性嗜盐细菌则很少更多是由非 培养的方法分离得到的。本研究利用培养方法分离 得到一株好氧革兰氏阳性中度嗜盐菌Y32对其进 行了16S rRNA基因序列分析以及较为系统的生理 生化等鉴定 16S rRNA基因序列分析表明Y32菌 株与Pontibacill“s属的两个模式种BH030004 和 BH030062-r的同源性在97左右但菌株Y32在细 胞大小、菌落形态及颜色、耐盐程度、氧化酶，硝酸 盐还原、水解七叶甙、淀粉、明胶以及
16、发酵葡萄糖、 果糖、麦芽糖产酸等方面与BH030004T和 BH030062T菌株有着显著差别 分类学上一般认为 16S rRNA基因序列同源性小于97的菌株极有可 能为不同种 结合形态学与生理生化试验结果，我 们认为菌株Y32为Pontibaeillus属的一个新种 命 名为Pontibacill“s spY32 菌株送中国典型培养物 保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCAM 100050。 参考文献： 1GRANT W DLife at low water activityJPhilosophical Transactions of the Royal Society of Londo
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