1、分类号： 单位代码：10019 密 级： 学 号： B05040245 博士学位论文 流感病毒种间重组三价灭活疫苗的 研制及初步评估 Generation and Evaluation of the Trivalent Inactivated Reassortant Influenza Vaccine as an Emergency Measure 研究生 ：杜 宁 指导教师 ：徐 镔 蕊 教授 申请学位门类级别：农 学 博 士 专业名称 ： 基 础 兽 医 学 研究方向 ： 动 物 分 子 病 理 学 所在学院 ：动 物 医 学 院 二 零 零 八 年 六 月 猪 源 H 9 N 2 亚 型
2、 流 感 病 毒 遗 传 变 异 和 感 染 特 性 研 究 Ph.D. Dissertation Generation and Evaluation of the Trivalent Inactivated Reassortant Influenza Vaccine as an Emergency Measure Ph.D. Candidate: Ning Du Supervisor: Prof. Binrui Xu Major: Basic Veterinary Medicine Research filed: Animal Molecular Pathology China Agricu
3、ltural University June, 2008 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或
4、扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I 摘 要 自从 1997 年香港发生了人感染禽流感病毒事件以来，世界各地多个国家先后出现人类感染 H5N1、H7N7 及 H9N2 亚型禽流感病毒发病甚至死亡的病例报道。说明有些禽流感病毒已经可以 直接突破种间屏障，给人类的健康造成巨大威胁。而以对禽类较低的致病性和广泛的宿主易感性 为特征的 H9N2 亚型禽流感病毒，很可能会成为下一次引起人类流感大流行毒株的基因供体甚至 是元凶。猪被认为是流感病毒的“中间宿主
5、”和“混合器” ，可同时感染禽流感病毒和人流感病 毒，并可以通过在猪体内的重组产生具有发病和流行潜能的新毒株。因此，为了预防随时可能暴 发的人类流感大流行，必须同时做好禽、猪、人流感的监控和防制措施，开展对于重组流感病毒 的研究、研制防控流感突袭的应急措施迫在眉睫。 基于这样的现状，我们设想，是否有一种疫苗，可以起到同时预防人流感、人禽流感、甚至 某些新型重组流感病毒的目的。本研究以三株不同种属的流感病毒作为研究对象，它们分别是人 流感 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、禽流感 A/chicken/Guangdong/126/2002（ H9N2）和猪流感 A/swine/He
6、bei/1/2005（H3N2） 。对分离株 H9N2 和 H3N2 进行鉴定分析后，运用死毒-活毒经鸡胚 基因重组技术，获得了三株表面抗原 HA 和 NA 分别来自灭活的人、禽、猪流感亲本毒株，而 6 个内部基因则来自活毒亲本毒株的重组流感病毒，分别为 H9/PR8、H3/H9N2 和 H1/H9N2。将分 别带有 H1、H3 和 H9 表面抗原的重组病毒制成福尔马林灭活的三价全病毒灭活疫苗，并在鸡和 小鼠动物模型中进行了安全性和免疫原性评估。 结果显示，特异性血清中和及终末稀释纯化后，可以稳定获得 2：6 组合的高产重组病毒。 该三价灭活疫苗在鸡和小鼠中具有良好的安全性和免疫原性。双剂量免
7、疫能够诱导鸡产生高水平 的 HI抗体， 并抵抗 H9N2亲本毒株的致死量攻击， 有效抑制咽喉部和泄殖腔排毒， 保护率为 100%。 小鼠干扰试验表明，三价抗原彼此之间不会产生干扰。双剂量免疫能够诱导小鼠产生高滴度特异 性 IgG 抗体，保护小鼠抵抗单一或多重亲本病毒致死量的攻击，保护率为 100%。含铝佐剂的疫 苗诱导的免疫反应较单纯无佐剂疫苗为高。 上述结果表明，这种多重种间基因重组流感灭活苗能够同时提供针对多种流感病毒的保护作 用。我们希望该研究可以拓宽针对人类流感大暴发时应急措施的研究思路，为防控人流感疫苗的 科研领域做出贡献。 关键词：应急措施；潜在流感大流行；重组A型流感病毒；三价灭
8、活疫苗 II Abstract It was believed that avian influenza per se were not a threat for humans. However, the recent emergence of novel avian influenza virus strains in human populations (influenza A/H5N1, A/H7N7, and A/H9N2 viruses) challenged these beliefs. These reports indicated that some avian influen
9、za viruses had obtained the ability to break throuth the barrier and infect humans. Although recent report suggested that the transmissibility of H9N2 viruses among humans appeared low, the studies suggested that H9N2 viruses had a wide range of hosts and might have evolved into a new pandemic strai
10、ns by the reassortment between human and avian influenza viruses. The characteristic ranks H9N2 viruses on the top of the list to cause human influenza pandemics in the future. Because pigs are susceptible to infect with both avian and human influenza A viruses, they have been proposed to be an “int
11、ermediate host” and “mixing vessel” for generation of pandemic virus through reassortment. Therefore, surveillance of human, avian and swine influenza, and developing emergency measure for the influenza pandemic should be given a high priority. One of the cornerstones of pandemic preparedness is the
12、 development and production of safe and immunogenic vaccines. As part of the influenza pandemic preparedness effort, we assume whether a multivalent influenza vaccine may be synchronously against multi-influenza viruses. Since the next pandemic threat may be reassortant viruses possessing gene segme
13、nts from different specific influenza viruses and there are not enough databases on researching multispecies reassortant virus vaccine, we simulated the process that might occur in nature and obtained three reassortant strains (2:6 reassortant) using three subtype influenza viruses (A/Puerto Rico/8/
14、34(H1N1), A/swine/Hebei/1/2005(H3N2) and A/chicken/Guangdong/126/2002(H9N2) viruses). The reassortants that were named as H9/PR8, H3/H9N2, andH1/H9N2 contained the HA and NA genes from the inactivated parental viruses and the 6 internal genes from the live parental viruses. We generated trivalent fo
15、rmalin-inactivated vaccine using these reassortant strains and evaluated the security and immunogenicity in chickens and mice. The RT-PCR results indicated that we successfully obtained the 2:6 reassortants using egg-based reassortant techniques following by two rounds of antiserum selection and thr
16、ee rounds of limiting dilution. The reassortants could be reproduced to high yields in the allantoic cavity of SPF ECE. As monovalent preparations in chickens, the vaccine produced anti-HA antibodies that specifically inhibited Ck/GD/126/02 virus and protected 100% chickens against the lethal challe
17、nge. As trivalent preparations in mice, the three subtype antigens had no cross-interferences with each other. The vaccine induced remarkably high titers of specific IgG antibodies and offered 100% mice to survive against lethal challenges of 7 different combinations of the three viruses of H9N2, H3
18、N2 and H1N1 viruses. Inactivated vaccine with alum adjuvant could induce higher antibody titers and longer protection. In conclusion, this kind of multrivalent inactivated reassortant influenza vaccine can offer multi-protection against multi-influenza viruses attack. We hope that this report will w
19、iden the scope of investigation on influenza vaccines and the weapons are ready to resist threat when the possible human III influenza pandemic and bird-flu attach together. Key words： Emergency measure; Potential influenza pandemic; Reassortant influenza A virus; Trivalent inactivated vaccine IV 目
20、录 摘 要 ABSTRACT . 第一章 文献综述 1 1 流感病毒的病原学 . 1 1.1 流感的历史1 1.2流感病毒的病原学 3 1.3 流感病毒分子生物学特性 6 1.4 流感病毒的遗传和变异 7 2 禽流感的公共卫生意义. 9 2.1 禽流感的历史 . 9 2.2 H5与H7 亚型流感病毒的生态学与公共卫生意义 . 9 2.3 H9亚型禽流感病毒的公共卫生意义 11 2.4人禽流感 11 3 猪作为中间宿主在流感病毒种间传播中的作用 13 4 中国南部作为世界流感发生中心的特点 14 5 禽流感疫苗的研究进展 14 5.1全病毒灭活疫苗. 15 5.2 基因工程苗 15 5.3 抗原
21、表位疫苗 17 5.4 减毒活疫苗 17 5.5 抗独特型抗体疫苗. 18 5.6 以哺乳动物细胞为基质制备的流感疫苗. 18 5.7免疫增强重组流感病毒体 19 5.8 有交叉保护性的广谱疫苗 19 5.9 结论 . 19 6 本研究的目的与意义 19 第二章 禽 H9N2 亚型流感病毒的分离和鉴定 21 1 材料 21 2 方法 24 2.1 病毒分离.24 2.2 病毒亚型鉴定.25 2. 3 病毒 HA 基因的克隆测序 .25 2.4 鸡胚半数感染量（EID50）的测定.25 2.4 静脉接种致病指数（IVPI）测定.25 V 3 结果.29 3.1 病毒分离鉴定结果及命名 .29 3
22、.2 病毒 HA 基因的扩增及测序结果 29 3.3 鸡胚半数感染量（EID50）的测定结果.30 3.3 静脉接种致病指数（IVPI）的测定结果.31 4 讨论 31 5 小结.32 第三章 种间重组流感病毒的制备及鉴定 . 33 1 材料.33 2 方法.35 2.1 H9和 H3 亚型流感病毒的小鼠肺脏传代实验 .35 2.2 亲本病毒的小鼠半数致死量（MLD50）测定.36 2.3 亲本病毒抗血清的制备 .36 2.4 筛选、鉴定重组病毒方法的建立.36 2.5 重组病毒的制备 .38 2.6 重组病毒的鉴定 .39 3 结果与分析.40 3.1 小鼠肺脏传代实验结果及 MLD50测定
23、结果.40 3.2 重组病毒鉴定方法的验证 40 3.3 子代重组病毒的鉴定结果分析.42 4 讨论.44 5 小结.45 第四章 三价全病毒灭活疫苗及佐剂的制备 46 1 材料.46 2 方法.47 2.1 病毒的浓缩和纯化 .47 2.2 病毒灭活 .47 2.3 三价全病毒灭活疫苗的制备 47 2.4 疫苗的无菌检验 .48 3 结果.48 4 讨论.48 5 小结.48 第五章 疫苗在鸡中的免疫效果评估 . 50 1 材料.50 2 方法.51 2.1 疫苗对鸡的安全性实验 .51 2.2动物免疫及攻毒实验51 VI 2.3 血清特异性 HI 抗体检测52 2.4 口咽及泄殖腔排毒检测
24、.52 2.5 统计分析 52 3 结果与分析 52 3.1 疫苗的安全性检测结果 . 52 3.2血清特异性 HI抗体检测结果 . 52 3.3 口咽及泄殖腔排毒检测结果 52 3.4 攻毒后存活率 53 4 讨论 54 5 小结 54 第六章 疫苗在小鼠模型中的免疫效果评估 56 1 材料 56 2 方法 57 2.1 三价抗原的干扰性实验. 57 2.2 动物免疫及攻毒实验.58 2.3 血清特异性抗流感病毒 IgG检测.58 2.4 小鼠肺脏病毒繁殖检测.58 2.5 组织病理学检测 58 2.6 统计学分析 58 3 结果 59 3.1 干扰实验结果 59 3.2 ELISA 实验结
25、果. 59 3.3 小鼠肺脏病毒繁殖结果及组织病理学检测结果 59 3.4 攻毒后小鼠存活率及体重变化 61 4 讨论 61 5 小结 63 结 论 . 65 展 望 . 66 创 新 点 . 67 参考文献 . 68 致 谢 . 81 作者简介 . 82 VII 符号与缩略语 （Abbreviations） 英文简称 英文全称 中文全称 AI avian influenza 禽流行性感冒 AIV avian influenza virus 禽流感病毒 bp base pair 碱基对 BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白 cDNA complementary DNA
26、 互补 DNA d day 天 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 dNTP deoxynucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核苷 EB Ethidium bromide 溴化乙锭 EDTA ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 EID 5050% egg infectious dose 鸡胚半数感染量 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 酶联免疫吸附测定 g gram 克 Gal gallactose 半乳糖 h hour 小时 HA hemaggluti
27、nin 血凝素 HI hemagglutination inhibition tests 血凝抑制试验 IU international unit 国际单位 IVPI Intravenous inoculation patopoiesis index 静脉接种致病指数 L liter 升 M marker DNA 标准 mg milligram 毫克 min minute 分钟 mL milliliter 毫升 MLD 5050% mouse lethal dose 小鼠半数致死量 MP matrix proteins 基质蛋白 mRNA messenger ribonucleic aci 信
28、使 RNA NA neuraminidase 神经氨酸酶 VIII 英文简称 英文全称 中文全称 NP nucleoprotein 核蛋白 NS nonstuctural protein 非结构蛋白 OIE Office International Des Epizooties 国际兽疫局 PA acidic polymerase protein 聚合酶蛋白 A PB1 basic polymerase protein 1 聚合酶蛋白 1 PB2 basic polymerase protein 2 聚合酶蛋白 2 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PC
29、R polymerase chain reaction 多聚酶链式反应 RNA ribonucleic acid 核糖核酸 RNasin ribosome nucleotase inhibitor 核糖核酸酶抑制剂 rpm rounds per minute 每分钟转数 RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction 反转录聚合酶链式反应 s second 秒 SA sialic acid 唾液酸 SIV swine influenza virus 猪流行性感冒病毒 SPF specific pathogen free 无特定病原体
30、 Taq Thermus aquaticsus 水生栖热菌 g microgram 微克 L microliter 微升 U unit 单位 WHO world health organization 世界卫生组织 中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 流行性感冒简称流感（Influenza） ，是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病 1 。根据病毒 粒核蛋白（NP）和膜蛋白（MP）抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为 A、B、C 三型。A 型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并也能在动物中 引起流感流行和造成大量动物死亡。B型
31、流感病毒常常引起流感局部暴发，不引起世界性流感大 流行。至今尚未找到它存在于人之外的其它动物中的确凿证据。C型流感病毒主要以散在形式出 现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行 2 。其中 A型流感病毒根据其表面（H 和 N）结构及 其基因特性的不同又可分成许多亚型， 至今 A型流感病毒已发现的血凝素有 15个亚型 （H1H15） ， 神经氨酸酶有 9 个亚型（N1N9） 。 禽流感（Avian Influenza，AI）是由 A 型禽流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的感染 或疾病综合症 1-3 。过去一直认为，能够感染人类并在人群中引起流行型感冒的流感病毒只有人流 感 H1，H2 和 H3
32、 三个亚型 4 ，禽流感病毒不能直接跨越种间屏障而对人类造成威胁 5 。然而近年 来多起人类感染禽流感事件（H5N1、H7N7 和 H9N2）向这一传统观点发起了严峻的挑战，人感染 禽流感在全球引发一场潜在的对健康的严重威胁。迄今为止，病毒的传播只限于从动物到人。但 由于禽流感病毒的基因突变或基因组亚单位重排，人传染人的可能性是存在的。最近已报道了第 一例可能的人传染人病例 6, 7 。猪被认为是流感病毒的“中间宿主”和“混合器” 8 ，可同时感 染禽流感病毒和人流感病毒，并可以通过在猪体内的重组产生可能具有大流行潜能的感染人和其 他哺乳动物的新的变异毒株 8 。因此，同时做好对禽流感和猪流感
33、的监测工作，不仅是流感流行 病学研究中的一项重要内容，也是有效防控人流感大暴发的必要前提。 1 流感病毒的病原学 1.1 流感的历史 流感的流行很早就被人们所认识,对它的流行情况也有不少记载。 我国古代医书中就有 “疫” 、 “瘟病” 、 “感冒”及“时行感冒”等记载。国外在这方面的记载比我国晚，直到公元前412 年希 腊的名医希波克拉底（Hippocrates）才有些记载 2 。流感病毒是唯一的能在短时间内引起世界范 围大暴发的病毒，可以在各年龄段的人群中引起发病。在20世纪，人类发生了4次流感大流行， 每一次大流行都给人类的生命健康带来了巨大的灾难和威胁。 上世纪世界范围内共出现五次流感大
34、流行： （1）西班牙流感：发生于 1918至 1919 年，造成 两千万人死亡，比第一次世界大战战亡的总人数还多，是由 H1N1 流感病毒引起。由于这次流行 最早公开发布的是西班牙，所以将这次流感称之为“西班牙流感” 。其实这次首发地是在美国中 部堪萨斯的兵营中。由于缺乏病毒分离株，所以无法对这次流感的病原做生物学特性的研究。近 来，有些人认为，该病毒可能最早来源于中国，但缺乏确凿的证据 2 。 （2）亚洲流感：发生于1957 年2月，最初在贵州出现并迅速传播至全世界，病原体为A型流感病毒 H2N2 亚型。 （3）香港流中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述 2 感：发生于 1968 年，
35、距 1957 年暴发的亚洲流感仅仅 11 年后，初出现于香港，后传播到日本、 美国等地。病原体为 A 型流感病毒 H3N2 亚型。Kawaoka 等 9 的研究表明，引起 1957 和 1968 年 两次世界性流感大流行的流行株，均为人源和禽源的杂交病毒。 （4）俄罗斯流感：暴发于 1977 年，引起这次流感暴发的病毒是 H1N1 亚型，血清学和遗传学分析显示与 50 年代流行的 H1N1 非常相似。 （5）香港 1997 年流感事件：1997 年 5 月，从香港一名死于重度肺炎与雷耶氏综合征 的3岁男孩体内分离到1株 H5N1亚型流感病毒，序列分析表明，该毒株的8个基因皆来自于禽 类 10
36、。至1997 年底，共有 18 位香港居民感染了 H5N1 亚型流感病毒，其中 6 人死亡 5 。这是禽 流感病毒跨越种间屏障直接感染人的最严重事件的首次报道， 该事件打破了人们对禽流感病毒的 传统认识模式，引起了全世界的恐慌。自 2003 年 1月到 2008年 4月为止，世界上共有 382 人感 染 H5N1亚型禽流感，死亡人数达 241人（见表 1-1） 。 表1-1. 2003 年1 月2008 年4 月30 日世界人感染H5N1 型禽流感情况（摘自WHO 网站） Table1-1. Cumultative number of confirmed human cases of avia
37、n influenza A/(H5N1) reported to WHO 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Total 国家 病 例 死 亡 病 例 死 亡 病 例 死 亡 病 例 死 亡 病 例 死 亡 病 例 死 亡 病 例 死 亡 Azerbaijan 0 0 0 0 0 0 8 5 0 0 0 0 8 5 Cambodia 0 0 0 0 4 4 2 2 1 1 0 0 7 7 China 1 1 0 0 8 5 13 8 5 3 3 3 30 20 Djibouti 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 Egypt 0 0 0 0 0 0
38、18 10 25 9 7 3 50 22 Indonesia 0 0 0 0 20 13 55 45 42 37 16 13 133 108 Iraq 0 0 0 0 0 0 3 2 0 0 0 0 3 2 Lao Peoples Democratic Republic 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 2 2 Myanmar 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 Nigeria 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 Pakistan 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 0 0 3 1 Thailand 0 0 17 12 5 2 3 3
39、0 0 0 0 25 17 Turkey 0 0 0 0 0 0 12 4 0 0 0 0 12 4 Viet Nam 3 3 29 20 61 19 0 0 8 5 5 5 106 52 To t a l 4 4 46 32 98 43 115 79 88 59 31 24 382 241 目前，我们需要知道的关键问题是下一次流感大流行会发生在什么时候，从什么地方，以什中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述 3 么方式暴发，这是关系到人类命运的大问题。 随着现代社会迅速发展，交通便捷、大量人员流动、气候多变、环境严重污染、人们生活方 式多种多样等外界因素的影响，只能初步判断，流感世界大流
40、行正在一步一步迅速地向我们人类 走来，越来越近。这不是危言耸听，我们人类准备好了吗 11 ？到目前为止，还没有一种确实可靠 的有效防治办法和手段出台。有人说，国内外不是有几家厂商研制出了AIV疫苗，都认为自己的 产品安全有效？！也有推荐国外的达菲（Tamiflu）治疗禽流感有效、金刚烷胺等对流感病毒有效 等等。另据报道，达菲的副反应可能很大，已有好几例人服用后引起了精神分裂症的问题。金刚 烷胺类和干扰素类药物，最近已有研究证明，它们对中国北方的 H5N1 AIV 变异毒株无效 12 。这 就提醒我们， 应尽快试研制出能有效控制流感大流行并有即时效应的防疫制剂。 然而， 因为人 （禽） 流感病毒
41、的特点，即在外界多重因素作用下迅速发生抗原变异或跨种间基因重组（重排） ，产生 新的变种，其将超过人们研制新疫苗的速度。那么如果使用现在在野外流行后分离的人（禽）流 感病毒毒株来研制流感大流行防控疫苗，积极准备的思维固然没错，如果该种疫苗现在使用也会 有一定的效果。但此时流感大流行在世界和地区并未发生，推广使用等于浪费资源。在仓库中保 存储备的话，如若干年后流感大流行时使用，其免疫人群的效果就很成问题。有学者研究证实， 近年分离我国北方的 H5N1 AIV 基因已明显发生变异 12 。等到若干年后应急使用现在研制好的疫 苗， 疫苗毒株的抗原基因肯定会与那时的野毒株抗原基因相差甚远， 疫苗免疫效
42、果就会发生问题。 那时将会有多少人名归黄泉？人类面临多大的危机？所以说应急防控流感大流行的疫苗在研制 思路上有待于进一步的改进和提高。这种情况，就要求我们现在就设计出探索一种多、快、好、 省的即时的在流感大流行时提供市场准确含有当时致病性流感野毒株抗原基因的应急防控疫苗。 因此，导致我们设计出在本论文第一章“本研究目的和意义”中阐述的新型疫苗的新思路，以迎 接流感大流行的严峻挑战。 1.2 流感病毒的病原学 流感病毒（Influenza virus, IV）属正黏病毒科（Orthomyxoviridae） ，流感病毒属，系线状单 股负链 RNA病毒。对外界环境的抵抗力不强，对高温、紫外线、各种
43、消毒药敏感，容易被杀死； 但对干燥和低温的抵抗力却很强，在70仍很稳定，冻干可保存数年。 1.2.1流感病毒的形态和结构 A、 B 型流感病毒是多形性的囊膜病毒， 常为球形， 其直径为 80120nm， 丝状体可长达数m， 它常见于刚分离到的病毒颗粒，A型比 B型病毒颗粒更为多见。病毒的核衣壳呈螺旋对称，外包 有囊膜，它来自病毒复制的宿主细胞，在囊膜表面有许多放射状密集排列的纤突。纤突长度约为 1214nm，分为两类，分别由三聚体的血凝素（HA）分子和四聚体的神经氨酸酶（NA）分子构 成，二者在囊膜上比例约为41。病毒粒子的中心还有一直径为4060nm的高电子密度的锥状 核心，即由病毒的核酸构
44、成的芯髓。 C型流感病毒无论是球形还是丝状体，其囊膜表面突起见不到呈四聚体的 NA。 中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述 4 图 1-1. A 型流感病毒电镜下两种形态 引自 WHO网站（左） ；CDC USA（右） 1.2.2流感病毒的基因及其产物 流感病毒基因组由8个单股负链 RNA组成，根据其大小分别以1、28表示，编码至少10 个蛋白，其中8个蛋白（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和M2）组成病毒的基本结构，两 个非结构蛋白（NS1 和 NS2）仅在被流感病毒感染的细胞中发现，而在同种正常细胞中找不到它 们，同时在病毒颗粒中也找不到它们的存在，故称之为非结构蛋白。
45、所有流感毒株的各个 RNA片段的5末端的 13个核苷酸和 3末端的12个核苷酸都是保守 的， 5末端的保守序列为 AGU AGA AAC AAG G， 3末端的保守序列为 UGG UUU UCG UCC。 每个片段的 5末端的第 1116 位核苷酸序列和 3末端的 1015 位核苷酸序列反向互补，通 过碱基配对形成锅柄环状的二级结构，这一结构是病毒RNA 聚合酶结合所必需的核苷酸识别位点 13 。 图 1-2. A 型流感病毒结构模型图示 引自 Paul Heinen, 2003 1.2.2.1 RNA13节段及其产物 中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述 5 流感病毒的聚合酶（Poly
46、merase）由三种成分组成，它们是 PB1、PB2和 PA，是病毒粒子中 分子量最大的蛋白质，由流感病毒3个最大的 vRNA片段（13）编码。 PB1 和 PB2 为碱性蛋白， 而PA为酸性蛋白。 RNA1和RNA2的长度均为2341个碱基，分别编码759 个氨基酸的 PB2 蛋白 和 757个氨基酸的 PB1蛋白。RNA3 长度为 2233 个碱基，编码 716个氨基酸长的 PA 蛋白。PB2 多聚酶的功能是识别和结合由宿主细胞多聚酶转录的帽子结构（ 7 mGpppGPNm） ，将帽子结构 从宿主细胞上切下并接到病毒特异的 mRNA 的 5末端上。 PB1 的功能是负责 cRNA和 vRN
47、A的 合成，还负责启动后新生的病毒颗粒 RNA合成的延伸 14, 15 。 1.2.2.2 RNA 4节段及其产物 RNA4 的长度为 17421778 个碱基，编码的蛋白是流感病毒表面的血凝素 （Hemagglutinin,HA）糖蛋白，是流感病毒的所有蛋白中最重要的一个。未经水解的 HA 称 HA 前身（HA0） ，它能识别红细胞表面的受体，使红细胞发生凝集，也能识别宿主细胞表面的受体， 但不能与宿主细胞膜发生融合，故不具有感染性。HA 功能的发挥要经过几个切割和加工过程， 包括信号的切除及裂解酶的裂解。HA 合成后信号肽酶将信号肽切除。另一个加工过程是将 HA 切割成两条多肽链，切割时去
48、掉一个或多个氨基酸残基，产生 HA1（重链）和 HA2（轻链） 16 ， 这是病毒感染细胞的先决条件 17 。 HA 是构成病毒囊膜纤突的主要成分之一，以同源三聚体的形式存在于囊膜表面，具有亚型 和株的特异性。HA基因及其产物的抗原性特性是 A型流感病毒亚型划分的主要依据之一，也是 型和亚型内新变种判断的主要依据。其主要生物学功能是：识别靶细胞受体并与受体结合；具有 与宿主细胞膜融合活性；以及诱导产生保护性中和抗体。 1.2.2.3 RNA 5节段及其产物 A 型流感病毒的 RNA5 节段长 1565 个核苷酸，5和 3末端分别有 45 个和 20 个核苷酸长的 非编码区， 开放阅读框含 14
49、94个核苷酸， 编码含 498个氨基酸的蛋白质， 称为核蛋白 （Nucleoprotein, NP） ，它与病毒颗粒 RNA节段相互作用形成核糖核蛋白颗粒（RNA ribonucleoprotein particle,简称 RNP） 。RNP 与 RNA 聚合酶一起构成病毒的核心部分。NP 是流感病毒中第二丰富的蛋白，占病 毒颗粒总蛋白的 25%，具有型特异性，是 A、B、C 三型流感病毒划分的主要依据之一，并且在 决定病毒宿主范围中起着重要的作用 18 。 1.2.2.4 RNA 6节段及其产物 RNA 节段 6 编码神经氨酸酶（Neuraminidase,NA） ，含 14431492 个核苷酸，编码约 459 个氨基酸长的 NA蛋白， 有45个糖基化位点。 NA是构成病毒囊膜纤突的另一个重要蛋白成分， 其成熟的形式是具有催化活性的四聚体 19 。NA基因特性及其产物
