1、 胰岛素的结构和性质(北京大学化学与分子工程学院 北京 100871)摘要 胰岛素是与人类健康有密切关系的蛋白质激素。在蛋白质的结构与功能研究中占有特殊的地位。本文对胰岛素的基本知识如胰岛素的发现,胰岛素的一级结构和高级结构,胰岛素的生物合成,胰岛素的生物活性及在临床上的应用进行简要的介绍。胰岛素(insulin)是一种蛋白质类激素。体内胰岛素是由胰岛 细胞分泌的。在人体胃的后下部 ,十二指肠旁,有一条长形的器官,叫做胰腺(图 1)。在胰腺中散布着许许多多的细胞群,叫做胰岛(图 2)。人胰腺中胰岛总数约有 100 万个1。胰岛素是由胰岛 细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰
2、高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素,是最早从胰腺中得到的激素,在蛋白质的结构与功能的研究中取得了多个 第一 。它是第一个被证明有激素作用的蛋白质,第一个被结晶的蛋白质,第一个被测定氨基酸序列的蛋白质,图 1人体胰腺(在胃的后下部)图 2胰腺中的胰岛第一个被人工合成的蛋白质,第一个被证明是以大分子前体形式合成的蛋白质和第一个用基因工程生产的蛋白质2 。1 胰岛素的发现由于胰岛散布在胰外分泌腺的汪洋大海中 ,因此在提取胰岛素时极易被蛋白水解酶降解而失活。加拿大外科医生FrederrickGrantBanting 看到一篇报道,提到在胰脏外分泌细胞坏死时 ,胰岛细胞仍然存活。于是他对胰岛中的活性
3、物质产生了浓厚的兴趣,希望能提取、分离胰岛中的活性物质。但当时他在英国工作的实验室条件较差,于是求助于多伦多大学生理系专门研究糖代谢的 J.J.R.Macleod 教授,希望他给予支持。 Banting 要求提供一间实验室及有关设备、一名协助他测定血糖和尿糖的助手以及实验用的狗等。当时 Macleod 教授勉强同意了 Banting 的要求并找了一名当时在多伦多大学医学院学习的四年级学生 CharlesH.Best 作为 Banting 的助手34 。研究工作在 1921 年暑假中进行,他们克服了许多困难和经历了多次失败后,结扎了几只狗的胰导管,7 周后,这些狗的胰腺都萎缩了,并失去了消化器官
4、的功能,而 胰岛从外观上看仍然是完好的。他们从狗的萎缩胰脏中抽提出具有活性的提取液,然后给切除胰脏并患有糖尿病的狗注射有活性的提取液,经过反复调节注射液的剂量,使几只切除胰脏并患有糖尿病的狗得以生存数周,其中一只患有严重糖尿病的狗居然存活了 70 天3;而作为对照实验,没有被注射有活性提取液而切除胰脏的狗,则因糖尿病几天后就死去了。 Banting 开始把提取的活性物质命名为isletin。Macleod 度假回来得知 Banting 的研究取得了令人兴奋的结果后,立即将他实验室的主要研究方向转向 Banting 开创的课题,并将胰岛素 isletin 更名为 insulin。Banting
5、与 Best 于 1922 年发表了他们的研究结果,并将初步纯化的动物胰岛素成功地应用于糖尿病人。1923 年,由于该项研究成果,Banting 与 Macleod 获医学和生理学诺贝尔奖。胰岛素的发现被认为是糖尿病史上的里程碑事件。为了纪念 Banting 的贡献,美国糖尿病协会把每年全美糖尿病研究的最高奖项命名为 Banting 奖。胰岛素的发现激发了各个领域科学家的兴趣,促进了关于胰岛素的生物合成、一级结构与高级结构的研究、化学合成、生物功能与作用机制的研究,在蛋白质的结构与功能的研究中取得前面提到的多个 第一 的重大成就。2胰岛素的一级结构与高级结构自从胰腺中提取的胰岛素得到结晶后 ,
6、英国科学家 Sanger 从 1945 年起,历经 10 年的研究,先将牛胰岛素拆分成两条链,然后用酸和蛋白水解酶分别进行部分水解得到一些小的肽片段,再用 2,4二硝基苯(Sanger!s 试剂,DNP 法)分别测定了两条链的氨基酸顺序56,于 1955年报道了胰岛素的一级结构7。1958 年,Sanger 因为该项成果获诺贝尔化学奖8。继牛胰岛素的结构测定后,Sanger 等人又测定了猪、羊胰岛素的一级结构。现在,各种常见动物的胰岛素的一级结构均已阐明。图 3 是猪胰岛素分子的一级结构示意图。圆圈中的字母代表不同氨基酸残基的缩写符号。由其一级结构可知,猪胰岛素相对分子质量为 5734,等电点
7、为 5.35。A、B 两条肽链共由 51 个氨基酸残基组成。A 链含有 11 种 21 个氨基酸残基,N 端为 Gly,C 端为 Asn,A 链本身的 6 位和 11 位上的两个 Cys 通过二硫键相连成环;B 链含 16 种共 30 个氨基酸残基,其 N 端为 Phe,C 端为Ala。A 链和 B 链又通过 2 个二硫键互相连接成胰岛素分子。不同动物胰岛素的一级结构中部分氨基酸残基是不同的。例如猪胰岛素 A 链的第 8、9、10 位氨基酸残基是 Thr、Ser 和 Ile;牛胰岛素为 Ala、Ser 、Va;l 而马胰岛素则为 Thr、Gly 和 Ile。人胰岛素和猪胰岛素仅在 B 链第 3
8、0 位氨基酸残基有区别( 人胰岛素为 Thr,猪胰岛素为 Ala)。由于不同来源的胰岛素结构差异,它们的抗原性不同,临床上应用与人胰岛素结构差异最小的猪胰岛素作为治疗药剂,也正是基于上述考虑。我国科学家历经 6 年多时间,于 1965 年完成了结晶牛胰岛素的全合成。经过严格鉴定,它的结构、生物活力、物理化学性质、结晶形状都与天然的牛胰岛素完全一样。这是世界上第一个人工合成的蛋白质9。1969年,英国科学家 Hodgkin 用 X 射线晶体学分析揭示了分辨率为 1.9的猪胰岛素的三维结构10。胰岛素分子晶体由 6 个胰岛素分子和 2 个 Zn2+形成含锌胰岛素的六聚体。首先,2 个胰岛素分子形成
9、二聚体,然后 3 个二聚体围绕三重轴形成对称的排列,B 链第 10 位上组氨酸的咪唑基与轴上的 Zn2+组成配位键。胰岛素晶体中锌的含量为 0.4%0.5%。六聚体也是胰岛素在 细胞中的储存形式。我国科学家在 1969 年至 1974年期间先后以 4(1970)、2.5(1971) 、1.8(1973) 分辨率,测定了猪胰岛素三方二锌晶体结构。这是继人工 20合成胰岛素之后我国蛋白质科学研究的又一重要成果11。这些研究成果为深入研究胰岛素分子结构与功能的关系奠定了基础。胰岛素的一级结构与其生物活性有密切关系。如用胰蛋白酶水解胰岛素 ,去除 B 链 C 端的 8 肽,生物活性只剩 1%。B23
10、甘氨酸、B24 苯丙氨酸等均为维持胰岛素生物活性所必需。二硫键被还原使胰岛素分解为 A 链和 B 链后,胰岛素的生物活性完全丧失。3 胰岛素的生物合成在研究胰腺的胰岛细胞腺瘤的过程中 ,Staeiner 发现了一个新的蛋白质,它是胰岛素生物合成的前体,命名为胰岛素原(proinsulin)12。胰岛素原是一条单一的多肽链(86 肽),它包含一个由 31 个氨基酸残基组成的连接肽。这个连接肽(称为 C 肽)连接 B 链的 C 端和 A 链的 N 端。当胰岛素原的二硫键被还原然后重新氧化时,可以形成正确的二硫键配对。胰岛素原的基本结构是(B 链)ArgArg(C肽)LysArg(A 链),在 C
11、肽的 N 端和 C 端通过碱性氨基酸二肽把 A 链和 B 链连接起来。图 4前胰岛素原加工成胰岛素的示意图13 继发现胰岛素原之后,Staeiner 又发现了一个能被胰岛素抗体沉淀的蛋白质 ,相对分子质量为 11500,命名为前胰岛素原(preproinsulin)13。胰岛素原的 N 端进一步延长 20 个左右的氨基酸残基(信号序列)就是前胰岛素原。不同生物体的信号序列长短有所不同。目前我们所了解的胰岛素的生物合成过程示意图见图 4。21人前胰岛素原也可用以下简式表示: 前胰岛素原酶胰岛素原酶胰岛素110氨基酸残基86 氨基酸残基51 氨基酸残基(2 个二硫键连接 A 链和 B 链)胰岛素是
12、在胰岛 细胞内质网的核糖体中合成的。首先,胰岛素结构基因在 RNA 聚合酶的作用下,转录生成前胰岛素原的信使核糖核酸(mRNA),后者从细胞核转入胞浆,在多核糖体内翻译为前胰岛素原。前胰岛素原的信号序列被信号肽酶切断生成胰岛素原。胰岛素原进入内质网腔后,内质网逐渐鼓起胞芽,并脱落生成小泡,这些小泡向高尔基体移动,并与之结合成为高尔基体的一部分。胰岛素原随着小泡进入高尔基体。在高尔基体内,胰岛素原被包裹成为未成熟颗粒。然后,在激素原转换酶 2(PC2)和激素原转换酶 3(PC3)及羧肽酶 H 的作用下,脱去连接胰岛素和 C 肽分子两侧的两个碱基氨基酸(3132 位 ArgArg,6465位 Ly
13、sArg),产生等量的胰岛素和 C 肽,整个过程约需几小时。随着胰岛素原的分解,未成熟颗粒逐渐成为成熟颗粒。颗粒内的胰岛素与 Zn2+结合形成含锌胰岛素晶体。合成的胰岛素储存在胰岛 细胞的 颗粒中。成人胰岛内贮存的胰岛素约 200 国际单位(IU)1415。4胰岛素的生物活性及临床应用胰岛素的生物效应包括许多方面,它是体内唯一能降低血糖的激素。也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。胰岛素的主要靶器官为肝脏、肌肉及脂肪组织,它控制着三大营养物质糖、蛋白质、脂肪的代谢和贮存。最明显的作用是影响糖的代谢,降低血糖16,即促进肝脏及肌肉组织中葡萄糖的利用,激活糖原合成酶和丙酮酸脱氢酶等的活性,
14、促进糖原的合成并抑制糖原的分解。此外,对肝脏来说还有抑制蛋白质分解的作用;在肌肉组织中促进 K+从细胞外向细胞内的转运;在脂肪组织中促进氨基酸由细胞外向细胞内转运,促进脂肪的合成 ,抑制脂肪的分解等作用。这些在细胞水平上对代谢系统的作用是基于胰岛素与其受体的结合得以实现的15。总之,胰岛素之所以能降低血糖,是因为它促进了靶细胞对葡萄糖的摄取(增加膜对葡萄糖的通透性) 、贮存(合成肝糖原和肌糖原)和利用( 用于合成脂肪和蛋白等)。当胰岛受到破坏、胰岛素分泌减少或机体组织对胰岛素的敏感性降低 (胰岛素的受体失效)时,则血糖升高,尿中出现葡萄糖,发生糖尿病(diabetesmellitus) 。糖尿
15、病是一种慢性代谢性疾病。也是一个影响着数亿人的复杂疾病。由于体内胰岛素相对或绝对不足,形成持续性高血糖,导致许多组织器官代谢异常,继而产生功能障碍及形态学异常。它是一种终生疾病。 如果胰岛机能亢进,则出现血糖过低 ,能量供给不足,甚至影响大脑机能。胰岛 细胞分泌的另一种多肽激素叫胰高血糖素(glucagon),是由 29 个氨基酸残基组成的单链多肽,其生物活性与胰岛素相反,通过刺激糖原分解提高血糖水平。所以它是升高血糖的激素。胰高血糖素主要作用于肝脏,刺激糖原分解,使血糖水平提高17。这对大脑的功能特别重要,因为神经元绝对依赖葡萄糖作为能源。当血糖浓度降到正常值以下时,肌体迫切需要注入葡萄糖到
16、血液。这时胰高血糖素作用于肝细胞,促进糖原分解和异生,以提高血糖的浓度2。有机体是一个精密调控的复杂体系,由不同生物活性的激素和其他活性物质的作用和相互制约,才能维持肌体的正常运转。胰岛素依赖型糖尿病称#型糖尿病,胰岛素绝对不足占主导地位 ,所以在治疗中必须补充胰岛素。非胰岛素依赖型糖尿病称型糖尿病,多数因胰岛素相对不足,治疗中是否补充胰岛素可根据病情而定16。糖尿病人中 5%10%属于#型糖尿病,约 4%的孕妇患有妊娠期糖尿病1。目前在临床上应用的胰岛素大部分已用人胰岛素代替了过去常用的动物胰岛素如猪胰岛素、牛胰岛素等,因为重组人胰岛素的问世才可能为糖尿病人提供人胰岛素。据报道,我国现在已成
17、功研制、开发出具有自主知识产权的基因重组人胰岛素,改变了长期以来依赖进口的局面。虽然注射人胰岛素可以替代内源胰岛素,但是由于胰岛素容易聚合成二聚体和六聚体,在注射后不能迅速进入血液,因此其作用比体内胰岛分泌的胰岛素的作用相对滞后。近年来通过基因定位突变和表达,可以得到聚合度低的单体速效胰岛素,其降血糖作用与体内分泌的胰岛素相近。现在重组单体胰岛素已在临床应用,可以预期它以后将取代重组人胰岛素18。另外,由于胰岛素易被消化酶水解,给药途径只能注射,不能口服。这给病人带来许多麻烦和痛苦16。因此,国内外都在致力于利用现代纳米技术研发非注射型(如口服、鼻喷雾、口腔喷雾等) 胰岛素制剂,但至今尚未见非注射型胰岛素产品上市。5 后记胰岛素是一个结构特殊的小蛋白质,又是具有重要生物功能的蛋白质激素 ,与人类的健康和疾病有密切关系。因此,有关胰岛素的研究始终是蛋白质研究中的热门课题。涉及胰岛素的文献数以万计。本文是从化学工作者的角度学习有关胰岛素基本知识的一点心得,供读者参考。中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞学研究
