1、 50 DNA 氧化损伤检测方法进展 黄雯 王旗 北京 大学公共卫生学院毒理学系，北京， 100191 摘要 DNA 是自由基特别是活性氧自由基攻击的重要靶分子之一，自由基导致的DNA 氧化损伤，可造成 DNA 分子的链断裂和碱基修饰等多种后果，与多种疾病的发生关系密切。 DNA 氧化损伤检测方法的标准化对有关研究至关重要，本文综述了目前广泛应用和新的 DNA 氧化损伤检测方法。 关键词 自由基； DNA 氧化损伤；检测方法 自由基是一类高活性物质，直接或间接地发挥强氧化作用，广泛地参与机体的生理与病理过程。自由基对 DNA 的攻击可以引起 DNA 分子的碱基修饰、 DNA 单/双 链的断裂、
2、链内交联、链间交联等。活性氧（ ROS），尤其是 OH，含有极为活泼的单电子，容易与亲核性的 DNA 分子结合，导致 DNA 碱基的修饰改变，胸腺嘧啶的氧化修饰产物有 20 多种，鸟嘌呤C8 位的氧化（形成 8-羟基脱氧鸟嘌呤）是最多见的，可引起 DNA 复制时碱基的错误配对及编码，导致基因突变，具有致突变、致癌的潜在危险 1。还有许多因素会造成链的断裂，如过氧化物，巯基氧化物，某些金属离子以及 DNA 酶等。 近年来发展了一些对自由基所致DNA 氧化损伤的检测方法， 检测方法的标准化在国际上 备受关注，本文将简述几种常用和新 的 DNA 氧化损伤 检测方法。 1. 测定 DNA 链断裂 DN
3、A 链的断裂是 DNA 氧化损伤的一个具体表现之一，分为单链断裂和双链断裂。断裂的产生主要是脱氧核糖在羟自由基攻击下遭到破坏，磷酸二酯键的断裂或碱基的破坏或脱落 2。 彗星试验 (Comet Assay) 又称单细胞凝胶电泳 (SCGE)，可定性和半定量地检测DNA 单链断裂水平，准确反映 DNA 损伤水平与修复的能力，是国际上流行的检测方法之一 3。各种内源性和外源性 DNA 损伤因子诱发细胞 DNA 链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等 膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、 RNA 以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核 DNA 由于分子量太大只能留在原位。在中性
4、条件下， DNA 片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下， DNA 发生解螺旋，损伤的 DNA51 断链及片段被释放出来。由于这些 DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的 DNA 会离开核 DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的 DNA 部分保持球形。 DNA 受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的 DNA 量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA 迁移部分 的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞 DNA 损伤程度。 在彗星试验中加入净化修复酶可以检验特定的损伤。甲酰胺基嘧啶 -DNA 糖基化酶（ FPG）是特异性识别和切
5、割甲酰胺基嘧啶和 8-羟基鸟嘌呤（ 8-OH-Gua）等的DNA 修复酶， SCGE-FPG 可反映甲酰胺基嘧啶和嘌呤碱基的氧化性损伤 4, 5。李达圣等应用 SCGE-FPG的方法发现砷引起人细胞 DNA 氧化性损伤，损伤的碱基主要是嘌呤或甲酰胺基嘧啶 6。而在彗星试验中加入内核酸酶 III，检测各种氧化嘧啶，也可以测定 DNA 氧化损伤水平，研究 DNA碱基修复的动力学。 2. 测定 DNA 碱基损伤 2.1. DNA 和蛋白自由基的免疫自旋捕集技术 自由基因其外部轨道上的不成对电子而表现出高反应性和不稳定性，同时也表现出顺磁性的特点。针对非成对电子导致的顺磁性，使用电子自旋共振（ ESR
6、）光谱法对自由基进行检测已成为自由基探测的“金标准”技术。然而，自由基具有高反应活性，只能稳定存在几微秒到几秒的时间，很快就从顺磁性转化为抗磁性（也称 ESR 沉默）。 自旋捕集（ Spin Trapping）技术是为了检测和辩认短寿命自由基，而将一种不饱合的抗磁性物质（ 称 自旋捕集剂，一般为氮酮和亚硝 基化合物） ， 加入 要研究的 反应体系，生成寿命较长的自旋加合物，再进行检测 。最常用的自旋捕集剂有 DMPO（ 5,5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide）， PBN（ Phenyl-tert-butynitrone ）， tNB（ nitroso-ter-buta
7、ne）等（如图 1） 7。 图 1 常用的自旋捕集剂的结构和反应原理 52 免疫自旋捕集技术 8是利用兔抗 5,5二甲基 -1-吡咯啉 N-氧化 物（ DMPO） 抗血清，将抗原 -抗体相互作用与自旋捕集特异结合。简单地说， DMPO 与吡咯啉 N-氧化环 C2 位上的辛酸 (OA)共轭生成半抗原（ DMPO-OA），并刺激 DMPO 捕集自由基。 DMPO-OA 复合物然后与卵 白 蛋白(OVA)共轭形成免疫原 (DMPO-OA-OVA)，以此对兔子进行免疫。抗血清用于免疫自旋捕集，可识别半抗原 (DMPOOA)， 游离的 DMPO， 蛋白（ DNA） DMPO 硝酮加合物。 加合物形成如图
8、 2 所示。 它的主要优势在于硝酮基 在 自然中 不存在 ，消除了细胞内产生假阳性的可能性。免疫自旋捕集 法包括 三个 主要 步骤： 1）原位 、 实时捕集大分子中心 自由 基形成稳定的硝酮加合物 ； 2）分离和（或）提 取 硝酮加合物 ； 3) 免疫检测（定位）硝酮加合物。 分析硝酮加合物可采用多种方法，例如，酶联吸附反应（ ELISA）、蛋白印迹（ Western blot） 、质谱分析法（ MS）、免疫细胞 /组织化学法等。此外，还可利用荧光显微镜法观察细胞内蛋白硝酮加合物的产生和位置，分子核磁共振成像检测和定位整体动物中的加合物。 图 2 肌红蛋白 -酪氨酰自由基与 DMPO 形成硝酮
9、加合物示意图 与 ESR 和 ESR-自旋捕集技术相比，免疫自旋捕集技术有如下优点： 1）该技术实用性强，不需要复杂的设备或物理化学和量子力学专家的帮助； 2）检测所需的样本量 较小（通常只需几微克），这对探测新系统来说非常重要； 3）可在多系统（生化、细胞、组织和整体动物）中检测、鉴别和定位生物分子自由基。例如， Kojima 等 9利用免疫自旋捕集技术在培育的TRL1215 和 RWPE-1 细胞中对无机砷造成的 DNA 氧化损伤进行了研究； Chatterjee等 10的研究则采用急性败血症小鼠为研究对象，观测小鼠脾脏内加合物的产生情况。 2.2 DNA 中 8-OHdG 的测定 DNA
10、 中碱基鸟嘌呤 C8 位易受羟自由基攻击，形成碱基修饰产物 8-羟基脱氧鸟嘌呤（ 8-Hydroxy-2deoxyguanosine ，53 8-OHdG）。 8-OHdG 是 DNA 氧化损伤的特异产物，是公认的内源性及外源性因素对DNA 氧化损伤的生物标志物 11。 当机体修复机制正常时， 8-OHdG 可在酶的作用下从 DNA 链上切除并重新掺入正常鸟嘌呤碱基，而切下的 8-OHdG 则经尿液排出体外。 8-OHdG 的检测方法主要有 酶联免疫法（ ELISA） 12、 32P 后标记法 13和高效液相色谱 -电化学检测法（ HPLC-ECD14。酶联免疫法（ ELISA）方法简单，特异
11、性强，灵敏度高，但测定的是 DNA 和 RNA氧化产物的总量 15。 32P 后标记法的灵敏度很高，但特异性有待提高，且易造成放射性污染。 HPLC-ECD 法需样品量小，灵敏度高，选择性好，可检测组织细胞 DNA和尿中 8-OHdG，是应用较广的方法。 分析组织细胞 DNA 中 8-OHdG 要先提取 DNA，再用核酸酶 P1 和碱性磷酸酶将 DNA 水解为单核苷酸，然后用用 HPLC分离， ECD 检测 8-OHdG，同时用 UV 检测脱氧鸟苷（ dG）， DNA 氧化损伤程度用8-OHdG 与 dG 的比值表示。尿中 8-OHdG含量较 低，杂质变动大，检测难度较大。尿样的净化是检测的关
12、键步骤 16。王旗等采用 C18 固相萃取净化尿样，高效液相色谱分离，库仑阵列电化学检测器检测，检测限达到 1 g/L（进样量 10 L），并成功地应用于六价铬盐和苯并 a芘现场尿样的测定 14。 值得注意的是，在哺乳动物中 8-OH-dG DNA 糖基化酶 (8-oxoguanine DNA glycosylase 1, OGG1) 酶负责 切除8-OH-Gua, 修复 基因多态性可能显著影响酶活性 。 2.3 DNA 中甲酰胺嘧啶的测定 甲酰胺嘧啶 4,6-二氨基 -5-甲酰胺嘧啶 (FapyAde)和 2,6-二氨基 -4-羟基 -甲酰胺嘧啶 (FapyGua)， 是 DNA 受羟自由基
13、 攻击 、紫外线辐射 或 光敏作用时产生的 主要损伤产物之一 。 FapyGua 是由 C8-OH 鸟嘌呤加合物自由基的一个电子还原产生，因此和 8-OH-Gua 有共同的前体物（见图 3）17；而 FapyAde 则是腺嘌呤的氧化损伤产物。原核和真核的 DNA 糖基化酶对清除这些损伤是高度特异的，在 DNA 修复途径的第一步即将其清除，近来许多研究也表明甲酰胺嘧啶与 8-OH-Gua 同样可造成碱基错配，在 DNA 氧化损伤的致突变损伤中 发挥着重要作用 18。 Delaney 等 19的研究发现 FapyAde 的致突变作用要强于8-OH-Ade； Kalam等 20用类人猿肾细胞对Fap
14、yGua 和 8-OH-Gua 的致突变性做了比较，发现 FapyGua 的致突变性要比8-OH-Gua 强 25-35%。甲酰胺嘧啶可作为 DNA氧化损伤的重要标志物。 54 图 3 鸟嘌呤 C8-OH 自由基加合物的氧化产物 用毛细管柱进行气相色谱 - 质谱(GC/MS)分析，并 用稳定 同位素标记 类似物 作为内标，可精确 测定 体内和体外的DNA 中 FapyAde 和 FapyGua 水平， 有极好的 灵 敏 度 和选择性 22。 GC/MS 分析方法主要包括以下步骤： 水解 DNA 释放FapyAde 和 FapyGua，水解衍生物，气相色谱分离，质谱法识别和定量 。 对于GC/M
15、S 来说， 首先 FapyAde 和 FapyGua一定要作为自由碱基从 DNA中解离出来。这一般 通过 甲酸 酸性水解 和 大肠杆菌修复酶 （ Fpg）水解实现。 释放出来的 碱基再通过 三甲硅烷 基 化 作用 转化为 可用于 气相色谱分离的挥发性 Me3Si衍生物 （图 4） 。冷 冻 干燥后用 CG/MS 分析。图 4 FapyAde、 FapyAde-13C,15N2、 FapyGua 和 FapyGua-13C,15N2 的 Me3Si 衍生物 结构（ *表示 13C 和15N 原子） 55 色谱分离时，采用 石英毛细管柱能 准确且精确地测量保留时间，有利于鉴别产物明确分离，还能通过
16、质谱同步测量大量的特征离子。电子电离（ EI）质谱能提供特征性的质谱来明确鉴别 FapyAde、FapyGua 和其他产物的 Me3Si衍生物 。 对于被修饰碱基的定量检测可采用同位素稀释的质谱法，采用它们各自的稳定同位素标记，类似于内标准，在水解作用前加入DNA 样本 23。 GC/MS 法适用于体内外 DNA 中FapyAde 和 FapyGua 的检测， 联合特征离子监测（ SIM）测量 GC 柱洗脱物中的FapyAde 和 FapyGua 的 Me3Si衍生物 时 ，灵敏度水平可达到 1fmol。同位素稀释质谱法 有效 识别和精确 定量活细胞内的DNA 损伤， 选择性和灵敏度水平 已达
17、到每106DNA 碱基中 1 个 损伤 。 3. 小结 由于 DNA 氧化损伤类型的复杂性，尽管近年发展了几种新的检测方法，仍难于检测微量的 DNA 氧化损伤，并存在人为氧化使结果偏高的可能。 HPLC-MS/MS 技术的发展，使特异检测 DNA 多种 氧化损伤产物成为可能。而检测方法的标准化对开展有关研究至关重要，在本世纪初已有 2 5个实验室参加欧洲 DNA 氧化损伤标准委员会（ ESCODD ），通过 DNA 提取方法等的实验室间评估比对，提出其推荐方法。国内学者也应重视 DNA 氧化损伤检测方法间和实验室间的比对工作，将会极大推进 DNA氧化损伤检测方法的进展。 参考文献 1 J Ca
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31、：北京大学公共卫生学院毒理学系 ； 电话 /传真：010-82801527， Email： qiwang_。 儿茶酚对 K562 细胞红系分化的影响及可能机制 李晓飞 薛明 吴小荣 王 棪 王杰 易宗春 * 北京航空航天大学 生物与医学工程学院，北京 100191 摘要 目的 儿茶酚既是苯在体内的酚类代谢产物之一，也 是重要的医药中间体 。儿茶酚在 儿茶酚氧位甲基转移酶 作用下可能 通过消耗甲基供体 S - 腺苷 - L - 甲硫氨酸（ SAM ）和生成甲基化抑制剂 S - 腺苷 - L 高半胱氨酸（ SAH ）抑制 DNA 的甲基化。 实验拟 研究儿茶酚对K562 细胞红系分化的影响， SA
32、M 和 SAH 在其中 可能 的作用， 以及 儿茶酚对 K562 细胞红系相关基因甲基化 状态 的 影响。 方法 联苯胺染色法 检测 K562 细胞血红蛋白合成情况，反转录 PCR 分析红系相关基因的 mRNA 表达水平， 定量 MassARRAY 甲基化检测法测定红系相关基因甲基化 程度。 结果 儿茶酚能够 浓度和时间依赖性地 促进 氯化高铁血红素诱导的 K562 细胞 血红蛋白合成 ， SAM 和 SAH 处理也均能 促进 氯化高铁血红素诱导的 K562细胞 血红蛋白合成；儿茶酚、 SAM 和 SAH 处理还能诱导红系相关基因 mRNA 表达；而且，儿茶酚处理后 K562 细胞部分红系相关
33、基因甲基化 程度出现显著降低 。 结论 这些结果 初步 表明 儿茶酚通过 COMT 的代谢影响了 红系 相关基因 甲基化 状态改变基因转录活性 从而改变 K562 细胞红系分化 能力 。 关键词 儿茶酚；儿茶酚氧位甲基转移酶；红系分化； DNA 甲基化 儿茶酚（ Catechol）又叫邻苯二酚，是苯在体内的酚类代谢产物之一；同时，作为重要的医药中间体 , 可用来制造止咳素、丁子香酚、黄连素和异丙肾上腺素等；另外，还可用于抗氧化剂、杀菌剂、染料、香料等的制备。一方面，儿茶酚作为常见的职业危害因素和环境污染物会苯在在内的代谢产物之一在苯引起血液系统等方面的毒性发挥重要作用；另一方面，由于工业上的大量生产，导致儿茶酚广泛的存在于水体和 土壤环境中 , 可直接对动植物的生长和发育造成了严重的影响与危害。有研究显示，儿茶酚可引起 HL60 细胞、人 CD34+骨髓祖细胞和人骨髓内皮细胞等造血细胞的细胞凋亡 1,2；Bukowska 等研究发现儿茶酚能够引起红细胞溶血的变化 3。作者最近研究了苯的酚类代谢物苯酚、氢醌和苯三醇对 K562 细胞红系分化的影响，发现它们对 K562 细胞的红系DNA氧化损伤检测方法进展作者： 黄雯， 王旗作者单位： 北京大学公共卫生学院毒理学系,北京,100191本文链接：http:/
