1、免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。服务说明冰冻切片荧光 tunel+免疫荧光双标 实验步骤1、 冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定 10min，待丙酮完全干后于 PBS（PH7.4 ）中在脱色摇床上晃动洗涤 3次，每次 5min。2、 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K 工作液 （蛋白酶 K 储存液用 PBS 1:9 稀释）覆盖组织，37 度温箱孵育 30mi
2、n。将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。4、 加试剂 1,2：按片子数量和组织大小取 tunel 试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂 2(dUTP)按 2:29 混合（试剂 1,2 为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37恒温孵育 2 小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、 BSA 封闭:将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min，在圈内滴加用
3、3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭 30min。6、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4C 孵育过夜。 （湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、 加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育 50min。8、 DAPI 复染细胞核：切片用 PBS（PH7.4）洗涤 3 次，每次 5min。去除PBS 后在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10min。9、封片：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次5min。切
4、片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长 330-380nm，发射波长 420nm；FITC 绿光激发波长 465-495nm，发射波长 515-555 nm； CY3 红光激发波长 510-560，发射波长590nm）石蜡切片荧光 tunel+免疫荧光双标 实验步骤1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯15-20min-二甲苯15-20min-无水乙醇10min-无水乙醇10min-95%酒精 5min-90%酒精5min-80%酒精 5min-70%酒精 5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。2、 修复：切片稍
5、甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K 工作液 （蛋白酶 K 储存液用 PBS 1:9 稀释）覆盖组织，37 度温箱孵育 30min。将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。4、 加试剂 1,2：按片子数量和组织大小取 tunel 试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂 2(dUTP)按 2:29 混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37恒温箱孵育 2 小时，湿盒内
6、加少量水保持湿度。5、 BSA 封闭:将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min，在圈内滴加用 3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭 30min。6、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4C 孵育过夜。 （湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、 加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育 50min。8、 DAPI 复染细胞核：切片用 PBS（PH7.4）洗涤 3 次，每次 5min。去除PBS 后在圈内滴加
7、 DAPI 染液，避光室温孵育 10min。9、封片：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长 330-380nm，发射波长 420nm；FITC 绿光激发波长 465-495nm，发射波长 515-555 nm； CY3 红光激发波长 510-560，发射波长590nm）注意事项1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于 4保存 4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
