1、1微生物产丁醇代谢微生物的产丁醇代谢摘要:丁醇作为一种传统工业原料,自二战前就开始被广泛应用,是印染、医药、香料等的重要原料。传统上用石油产品作为生产原料,如今,丁醇被赋予了新的用途,即汽车等燃料的替代品。为了节约成本,加强环保,各个实验室开展了生物法制丁醇的研究。本文介绍了微生物产丁醇的一些菌种,以及产丁醇代谢的过程,最后介绍了现在的应用状况以及前景。关键词:丁醇 厌氧发酵 汽油 梭菌简介丙酮丁醇是一种重要的有机溶剂和化工原料,广逆用于喷漆、炸药、塑料、制药、植物油提取及有机玻璃、合成橡胶等工业2,3,4,1117。目前生产方法有化学合成和发酵法两种13:发酵法产丁醇曾经是世界上仅次于酒精发
2、酵的第二大发酵2产业2,9,而现在常用的是石油产品进行化学合成。石油资源紧缺而导致的石油价格持续上涨已成为不可逆转的趋势12,而丁醇作为一种替代的清洁性能源,其生物学制法越来越受到关注。国内生产生物丁醇(ABE 发酵) 主要是以玉米为原料,利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)发酵7,而国外一般使用拜氏梭菌,用蜜糖为发酵原料8。梭菌属严格厌氧,能形成芽孢、厌氧生长的革兰氏阳性杆菌。因芽孢常比菌体大,致使菌体呈梭状而得名,又称厌氧芽孢杆菌属。现在已知的梭菌都是产生正丁醇的,近期,美国杜邦公司和加州大学发现一种使用藻类产生异丁醇的工艺,现在处于保密阶段。本文中如无
3、特指,丁醇均是指正丁醇。1. 发酵原理丙酮丁醇发酵包括 2 个不同的时期:产酸期和产溶剂期。产酸阶段,细胞处于指数生长期,主要产生乙酸、丁酸、H2 和 CO2,有机酸的产生引起了发酵液 pH 的下降;随着有机酸积累到一定阶段(pH 达到 4 .34.5) ,发酵进入产溶剂期,此时细胞处于稳定期,产生 的乙酸和丁酸在这一阶段转变为 ABE,随着发酵 的进行,丙酮丁醇梭菌开始衰老,活力下降,加上底物的消耗,溶剂的毒害作用,使菌体开始自溶或生成3孢子,发酵逐渐由微弱最终达到静止结束11。如图 1,是整个产丁醇的反应的流程及相关酶类。图 1 产丁醇代谢流程及相关酶如上图,梭菌中有几种特殊的酶,对产丁醇
4、代谢起着关键的调节作用11。在反应的整个代谢途径有 3 个重要的中间代谢产物:乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA 和丁酰-CoA,这 3 个产物引起了有机酸和溶剂的产生。因此,推动这三种物质产生的酶是整个反应的关键酶。通过基因沉默实验也验证了这一假设9。2. 菌种筛选及产物的测定2.1 菌种筛选目前,丙酮-丁醇发酵主要的菌种选育手段是诱变育种。由于初筛得到的菌种往往丁醇产率及耐受能力很差,需要经过诱变二次筛选才有实用价值。目前常用的方法为 2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选。通常使用的诱变剂为 N+离子3,亚硝酸亚硝基类7等。流程如图 2。图 2 诱变育种流程图原始菌种通过初筛得到,采用沼气池发酵液 、
5、 牛粪、4土壤作为菌种来源。通过富集培养有大量气泡和醪盖的培养基进行气象色谱;以及分离纯化稀释到 10-8,滚管技术分离单菌落,TYA 培养基(用于厌氧菌培养)培养就可以初步得到有产丁醇能力的菌种。此外,还可以进行工程菌种的构建11。如 E.Coli 工程菌构建。近年来,人们利用基因工程技术对大肠杆菌的代谢途径进行加工改造,构建的大肠杆菌工程菌能够产生丙酮、丁醇。Bermejo等人构建丙酮的操纵子 cet4(adc,ctlAB 和 th1)的质粒pACT,并成功转化大肠杆菌,首次在大肠杆菌中构建了产丙酮的工程菌,工程菌发酵 后能够产生丙酮。另外,Atsumi、Inui 等人分别克隆了丙酮丁醇梭
6、 菌中合成丁醇途径的关键基因 thl、hbd、crt 、bcd-etf、B-etfa 、adhE,使其控制的硫解酶、3-羟基丁酰-CoA 脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA 脱氢酶和醛醇脱氢酶在大肠杆菌中成功表达,工程菌发酵后产生丁醇。2.2 发酵工艺及产物测定丙酮丁醇梭菌(C .acetobutylicum) 可产 淀粉 酶, 能利用淀粉质原料生产丁醇, 淀粉酶酶活与其产丁醇的能力之间存在一定相关性,丁醇抗性株5C.acetobutylicum SA-1 的丁醇产 量提高是由于 淀粉酶酶活力提高。 淀粉酶酶 活的提高可以加快 C .acetobutylicum 利用淀粉转化为丙酮丁醇, 提高发酵
7、法生产丙酮丁醇的产量9。葡萄糖和果糖可使延滞期缩短,但是抑制 淀粉酶活性13。采用萃取发酵、气提发酵、膜分离发酵、吸附发酵等手段与丙酮、丁醇发酵工艺相耦合。丁醇发酵的主要产物测定是丁醇,但由于副产物像丙酮等对菌体生长有很大危害,因此也需要测定其含量。首先采用精馏法分离产物,然后利用气象色谱分析产物含量,如图 3,是简略的流程图,用的是目前比较好的发酵与气提分离耦合工艺2。图 3 发酵与气提分离耦合工艺示意图3. 应用状况及展望3.1 生物制丁醇发展史生物制丁醇由来已久: 1861 发现,到二战广泛应用;我国 1954 年以后开始兴起丁醇工业,由于石油工业的兴起,生物制丁醇在 1996 年衰落;
8、至 2005,美国对丁醇做汽车燃料进行了测试,紧接着 2006 杜邦公司宣布他们将与英国BP 公司合作开发生物丁醇燃料项目 一期工程拟建设以甜菜为原料、年产 3 万吨生6物丁醇燃料的生产装置,并在英国市场上用生物丁醇来替代汽油作为车用燃料。 值得注意的是,根据美国相关部门统计,油价在 3O40 美元/桶以上,发酵法制丁醇就具有竞争性12。3.2 丁醇的新应用传统丁醇多数应用于化学以及医药工业,但是,最新研究表明,丁醇作为一种优良的汽油替代品具有广阔的前景1,10。丁醇作为燃料,有以下几个优势:第一,丁醇与汽油的配伍性更好,能够与汽油达到更高的混合比。汽油 C6-C8,乙醇与汽油混合比的极限为
9、10 ,而汽油中允许调入的丁醇可以达到 206。第二,丁醇具有较高的能量密度,具有较好的燃料经济性。第三,丁醇亲水性弱,能与汽油以任意比例混合丁醇的蒸汽压力低,腐蚀性小、便于管道输送。湖南大学的一个课题组对 20%的丁醇-汽油混合燃料进行了初步实验研究6,结果表明:1) 丁醇是一种非常有潜力的车用替代燃料;2) 体积掺混率达 20%的丁醇一汽油混合燃料对发动机的动力性几乎不造成影响;3) 由于丁醇热值低而密度大,因此导致燃料消耗率略有7提高;4) 丁醇混合燃料的 HC 和 CO 排放得到明显改善。3.3 丁醇相对乙醇的优势1)2)3)4)5) 总结国内外相关研究,发现作为燃料,丁醇比乙醇有很大
10、优势。 丁醇碳链更长,与汽油更接近,相容性更好; 丁醇挥发性较乙醇低,便于储藏和使用; 丁醇对管道等的腐蚀性小于乙醇; 丁醇燃烧产生的能量多余乙醇,产生的废气同乙醇相差不大。3.4 应用局限尽管优势明显,但是生物法依然有许多不足,如使用玉米等粮食作为原料,菌种自身问题(产率、耐受性) ,环保(丁醇及其副产品有毒)等。在这里提出几种可能的解决方案:1) 原料替代(使用纤维素类作为替代原料)2) 菌种优化(增强产出率、提高耐受力、构建工程菌)3) 提取方法改良(气提、萃取、蒸馏)4. 总结木质茎、稻草、农业残余物、玉米纤维和外皮都含有大8量的纤维素和部分木质素,这些木质纤维材料都可用于制造生物丁醇
11、。丁醇被认为是一种优于乙醇的生物燃料,因为他的腐蚀性更小,热量值更高。如同乙醇一样,丁醇也可添加到汽油中。而随着石油资源的枯竭,石油价格的节节攀升可再生农业生物质供应的相对充足 以及生物丁醇以及丁醇生产菌种优化、产溶剂梭菌遗传操作系统的研究技术、发酵和下游产品提取技术的不断进步 必将使得生物丁醇的成本大大降低,大规模生产燃料丁醇的时机即将到来。参考文献1 严隽森. 把我国广大的沙化草原建设成为可再生的世界级特大的清洁能源生产基地J. 中国工程科学 2010 12(3):22292 童灿灿,杨立荣,吴坚平等.丙酮-丁醇发酵分离耦合技术的研究进展J.化工进展 2008 27(11):1782178
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