1、第三章 酶化学第一节 通 论一、 什么是酶？酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起同样催化作用的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸，是生物催化剂。二、 酶与一般催化剂相比较的共性和个性特征：共性：1、用量少，催化效率高。2、能加快化学反应的速度，而其本身在反应前后没有结构和性质上的变化。3、只加快反应速度，不改变反应常数。个性特征：1、催化效率比一般催化剂高出 107-1013。2、更易受环境因素的影响，酶是蛋白质和核酸，易变性失活。3、酶的催化活性是被调节控制的、有序进行的。4、条件温和：常温常压，pH 中性。5、具有高度专一性，只对特定的一种或一类底物起作用。a:什么是
2、酶的底物? 被酶作用的物质,也称作用物。b:酶的专一性,即酶作用的专一性，也称酶的底物专一性,指酶对它所催化的反应或反应物有严格的选择性,即它只能催化一种或一类反应,作用一种或一类物质。三、 关于酶专一性解释的几个假说。 （见书中的图）1 锁钥学说：只说明酶底物的结合，但并未说明能催化专一性，应包括结合专一性和催化专一性。2、三点附着学说：同上。3、诱导锲合学说：酶分子本身不是一层不变的，酶和底物的结合诱导酶分子空间构象发生变化，它的催化基团与底物的敏感键接触，形成酶与底物复合物。第二节 酶的分类和命名一、酶的命名：两种方法命名。1、习惯命名法（传统命名法） 根据催化底物命名：如蛋白酶。 根据
3、催化反应的性质命名：如脱氢酶。 根据和同时命名:如乳酸脱氢酶。 加上来源及其他性质：如胃蛋白酶、碱性磷酸酶。2、国际系统命名法 一个重要机构：国际生物化学联合会酶学委员会(EC)。 每个酶应有习惯名称和系统名称系统命名的原则：a：底物（如果两个底物，都应写出来，如果其中一个底物为水，可省去） 。b：催化反应性质：如 -酮戊二酸氨基转移酶。二、分类 分类原则：按催化的反应类型分为六大类，分别编为：1、氧化还原酶类；2、转移酶类；3、水解酶类；4、裂解酶类；5、异构酶类；6、合成酶类。（二） 、六大酶类的特征及反应通式氧化还原酶类催化氧化还原反应，AH 2+B=A+BH2 ，如乙酸脱氢酶等。转移酶
4、类催化一个化合物的某一基团转移到另一化合物上，A-R+C=A+C-R，如转氨酶类等。水解酶类催化底物加水分解或其逆反应，A-B+ H 2O=A-H+B-OH。裂解酶类催化底物的裂解或其逆反应，A-B=A+B。异构酶类催化同分异构体的互变，A=B。合成酶类催化由两种或两种以上物质合成一种物质，由 ATP 供能，A+B+ATP=A-B+ADP+Pi。三、酶的组成分类1、按组成分类分为两大类：简单酶：只含有 aa。结合酶：也称全酶或复合酶，由酶蛋白和非蛋白质的辅助因子组成。2、什么是酶的辅助因子？是指酶的对热稳定的非蛋白小分子有机化合物，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应，并促进整个
5、催化过程。3、辅助因子：辅基：以共价键与酶蛋白结合，不与分开辅酶：结合疏松，可用透析方法去除辅酶而使酶活性丧失包括 传递电子体，卟啉铁 递氢体，NAD/NADP、FMN/FAD、硫辛酸 递酰基体，TPP、COA 递-碳基团：四氢叶酸 递磷酸基，ATP、GTP 等。第三节 酶催化作用的结构基础和高效催化的策略一、酶分子结构的特征1、具有活性中心 什么是酶活性中心？指酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间部位，它是酶行使催化功能的结构基础。 特点：a:活性部位只占酶整个分子很小的部分，通常只有几个 aa 残基组成。b:酶的活性中心是个三维实体，是在酶的高级结构中形成的，酶的活性中心的 aa 残基
6、在一级结构可能相距很远，但在空间结构上十分靠近。c:酶与底物的结合是活性部分与底部的形状发生诱导锲合的过程。d:酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，底物分子就结合到这个裂缝内，裂缝内含较多疏水基团，有利于结合催化。e:酶活性中心是可运动性的，酶活性中心与底物的结合通过次级键。 组成：由两个功能部位组成，即结合部位和催化部位。结合部位：酶分子中与底物结合的部位，决定酶的专一性。催化部位：酶分子中促使底物发生化学变化的部位，决定酶所催化的反应性质。* 酶分子的完整性是酶催化功能行使的重要保证。2、具有必需基团：指酶表现催化活性不可缺少的基团，指在活性中心之外的某些区域，不与底物直接作用。亲核性
7、基团：Ser-OH、Cys-SH、His 的咪唑基；酸碱性基团：Asp 和 Glu 的-COOH、lys-NH 2；举例说明：胰凝乳蛋白酶它的酶活性中心是由 His57、Asp102 和 Ser95 组成，但酶活性作用的表现还需ile16 和 Asp194 参与，它们就是必需基团。二、如何证明活性中心的存在？（自学）三、酶原与酶原的激活 什么是酶原？指没有活性的酶的前体，如胃蛋白酶原。 什么是酶原的激活？指酶原在一定条件下经适当的物质作用转变成有活性的酶的过程，使无活性的酶原转变成有活性的酶的物质叫致活素，酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的过程。举例：胰蛋白酶原 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶原
8、、弹性蛋白酶原、羧肽酶原肠激酶 激活 胰蛋白酶是胰脏中所有蛋白酶原的共同激活剂。 说明胰蛋白酶原的激活过程 生物体内的双重保险措施；蛋白酶抑制剂的存在。蛋白酶抑制剂是一个有效的底物类似物，能与酶的活性中心紧密结合，使酶活性受到抑制。为什么吸烟者患肺气肿的可能性大？吸烟使蛋白酶抑制剂分子中的 Met358 氧化，它是该抑制剂与酶活性中心结合必需的 aa，它的氧化使抑制剂无法与酶活性中心结合，使过量的弹性蛋白酶消化弹性纤维及其他结缔组织蛋白质而导致肺气肿。 一些酶以酶原的形式分解出来是为了保护自身组织免受由于酶超前激活导致的损伤。四、酶作用的机制（酶高效催化的策略）：促使酶具有高效催化作用的因素。
9、任何一个化学反应只有活化能的降低才能进行，因此过渡态的形成和活化能的降低是反应的关键，任何影响过渡态形成与稳定的因素都会影响酶的催化活性。1、临近定向效应：底物与酶的“靠近”及“定向” 。 提高酶活性中心部位的底物浓度，有利于提高反应速度，这就需要底物分子向酶活性中心靠近，从而形成局部高浓度。 酶与专一性底物结合后，酶分子构象发生变化，使其催化基团和结合基团正确排列定向。另一方面，底物分子中参与反应的基团相互靠近，定位。2、底物分子变形和扭曲两方面： 酶与底物结合时，底物诱导酶的构象改变，特别是活性中心的结构变化。 酶的变化同样会诱导底物分子中的敏感键变形，从而使酶与底物的中间产物进入过渡态。
10、3、酸碱催化： 酶催化是广义的酸碱催化。 什么是广义的酸碱催化？：由质子酸提供质子或由质子碱接受质子，达到降低活性能的过程。 酶分子上有很多酸性和碱性基团，可以进行酸碱催化。其中组氨酸中的咪唑基是酶酸碱催化中最活泼的基团，主要的广义酸基团和碱基团如下：广广 义义 酸基酸基 团团 广广 义义 碱基碱基 团团（质质 子供体）子供体） （质质 子受体子受体 ）举例：特别指出胰凝乳蛋白酶的催化机制（见书中图解释）4、共价催化： 定义：指催化剂与底物之间瞬间形成共价键，从而形成共价过渡产物，使反应活化能降低，提高反应速度的过程。 那些基团可以进行共价催化呢？原则是容易形成共价键，又在最后一步较容易离去、
11、释放产物的基团。上面讲的广义酸碱催化基团，同时也是共价催化基团，如 Asp 羧基，Ser 的羟基等。5、中间产物学说：E+S ES E+P 证明方法：电镜、 X-RAY、光谱变化和生物分离ES。第四节 酶促反应的动力学那些因素影响酶促反应的速度？这里的速度指的是初速度。初速度：指在酶促反应过程中，初始底物浓度被消耗 5%之内的速度。一、酶浓度的影响：当 S 浓度很大，过量时，反应速度就与 E 的浓度成正比。二、底物浓度对反应速度的影响：1、在酶浓度、pH 和温度等条件不变的情况下，看看底物浓度对反应速度作图的结果如下：-COH, -N3, -SH,+ONH+ -CO , -NH2, -S ,.
12、O-NH:A：当底物浓度低时，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应；B：当底物浓度达到一定值时，几乎所有的酶都用完了，即使在增加底物，速度也不再增加，表现为零级反应；C：这里面须注意；在反应速度达到最大值一半时，所对应的底物浓度。2、米化方程： 快速平衡理论与稳态平衡理论A: 1913 年 Michaelis 和 Menten 提出一个快速平衡理论，假定 E+S ES E+P，方程中 E+S ES 迅速达到平衡，底物浓度远远大于酶浓度时，ES 分解成产物的逆反应可忽略不计，因此在“快速平衡”理论的基础上推导出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反应速率之间的定量关系，成为方程：Km 米氏常数
13、Vmax 最大反应速度 B：稳态平衡理论1925 年 Briggs 和 Haldane 提出，并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米式方程。“稳态” 反应进行一段时间后，ES 浓度增加到一定值，同时 ES 也在不断分解，只有当 ES的生成速度与分解速度相等时，ES 的浓度才保持不变。C：所以“稳态理论”的修正之处在于： 酶促反应的速度，同时与 ES 的生成速度和分解速度均直接相关 当 ES 分解速度=ES 生成速度时，ES 浓度不变。 真正米化方程的推导过程：米氏常数米氏常数 Km 的意的意 义义 :由米氏方程可知，当反由米氏方程可知，当反 应应 速度等于最大反速度等于最大反 应应 速度一半速
14、度一半 时时 ,即即 V = 1/2 Vmax, Km = S 上式表示上式表示 ,米氏常数是米氏常数是 反反 应应 速度速度 为为 最大最大 值值 的一半的一半 时时 的底物的底物 浓浓 度度 。因此因此 ,米氏常数的米氏常数的 单单 位位 为为 mol/L。V=max SK +不同的不同的 酶酶 具有不同具有不同 Km 值值 ，它是 酶酶 的一个重要的特征物理常数。的一个重要的特征物理常数。Km 值值 只是在固定的底物，一定的温度和只是在固定的底物，一定的温度和 pH 条件下，一定的条件下，一定的 缓缓 冲体系中冲体系中 测测 定的，不同条件下具有不同的定的，不同条件下具有不同的 Km值值
15、 。Km 值值 表示表示 酶酶 与底物之与底物之 间间 的的 亲亲 和程度和程度 ：Km 值值 大表示大表示 亲亲 和程度小， 酶酶 的催化活性低的催化活性低 ; Km 值值 小表示小表示 亲亲 和程度和程度大大 ,酶酶 的催化活性高。的催化活性高。 米氏常数 Km 的测定： 测测 定定 Km 和和 V 的方法很多，最常用的是的方法很多，最常用的是 LineweaverBurk 的作的作 图图 法法 双倒数双倒数作作 图图 法法 。取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：三、温度对酶促反应速度的影响1、并不是温度越高越好，因为酶是蛋白质，温度高易变性失活。2、酶的最适温度：显示酶最大活
16、力的温度。3、最适温度不是酶的特征常数，受各种环境因素影响，因此在提及最适温度时必须指明是什么条件。四、pH 对酶促反应速度的影响1、pH 值的不同会影响酶活性中心和底物上的一些重要基团的解离。2、最适 pH：一种酶只在某一 pH 范围内表现最高催化活性，显示此最高酶活性的 pH 值。3、大多数酶的反应速度对 pH 的变化呈钟罩形曲线，个别的只有钟罩曲线的一半。1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax-4 -2 0 2 4 6 8 100.0.20.40.60.81.01/S(1/mol.L-1)1/v1/Vmax-1/Km斜率=Km/Vmax五、激活剂对酶促反应速度的影响1、什么
17、是酶的激活剂？凡能提高酶活性，加快酶促反应速度的物质。2、分类：无机离子、大分子有机物、生物大分子。3、激活剂对酶的作用有选择性，对一种可激活，而对另一种酶可能抑制。六、抑制剂对酶反应的影响1、什么是抑制作用和失活作用？两者的区别是什么？什么是抑制剂？A：抑制作用：有些物质能与酶分子上的某些基团，特别是活性中心的必需基团结合，使酶的活性中心的结构和性质发生改变，导致酶活力的下降或丧失，这种作用称为。B：失活作用：凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。C：两者区别：抑制剂对酶的抑制作用有选择性，一种抑制剂只能引起一种酶或一类酶的活性丧失或降低，而蛋白质变性剂可使所有的酶变性失活。 在抑制剂与酶
18、的结合而导致的抑制作用中，抑制剂一般都具有以下特点：一方面在化学结构上与被抑制酶的底物分子或底物的过渡态相似（结构上） 。另一方面能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物，而变性剂则作用方式较多。D：什么是抑制剂？能引起酶抑制作用的物质。2、抑制作用的类型：按照可逆与不可逆分为两类：可逆抑制作用和不可逆抑制作用。不可逆抑制作用A：定义：抑制剂与酶反应中心活性基团以共价键方式结合，引起酶的永久性失活，不能用透析等方法通过去除抑制剂而使酶活性恢复的作用，称为。B：类型: 重金属离子，如砷、汞 有机磷化合物 氧化物，如 CO 等。 可逆抑制作用A：定义：抑制剂与酶以非共价键
19、方式结合而引起酶活性暂时性丧失，可以通过透析等方法除去而使酶活性部分或全部恢复的作用。B：类型：竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用竞争性抑制作用：定义：有些抑制剂的结构和酶底物的结构类似，因而能与底物竞争与酶活性中心的结合，当抑制剂先与酶结合，底物就不能结合，若底物先与酶结合，抑制剂就不能与酶结合，因此当体内有竞争性抑制剂存在时，抑制剂与酶的结合影响底物与酶的结合，导致反应速度下降。特点：酶对底物亲和力下降 km 增加最大反应速度不变 可以通过增大底物浓度提高底物竞争力。举例：磺胺类药物的设计(自学)非竞争性抑制作用：定义：底物和抑制剂与酶的结合没有竞争性，底物和酶结合后还可以
20、与抑制剂结合，同样抑制剂与酶结合后还可以与底物结合，即酶可以同时和抑制剂及底物结合形成酶-底物-抑制剂三元复合物，但后者不能转变为产物，这种作用称为。特点：km 不变 最大反应速度降低 酶对底物亲和力不受影响不能通过增大底物浓度去除各种抑制作用举例：金属离子，EDTA 等。反竞争性抑制作用：定义：抑制剂不与酶结合，只与 ES 复合物结合，引起酶活性下降，这种作用称为。特点：km 减少 酶对底物亲和力增加 最大反应速度减少 也无法通过改变底物浓度而改变反应抑制剂的影响。举例：多底物反应中第五节 酶的分离纯化和活力测定一、酶的分离纯化：基本原则：提取过程中避免 酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高
21、温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入 缓冲溶液.基本操作程序：a.选材：微生物（微生物发酵物: 胞内酶，胞外 酶）， 动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD 酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）。b.抽提：加入提取液提取。胞内 酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复 冻融或自溶等），c.分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶 剂沉淀法，超离心等）。d.纯化：可采用离子交换层析，凝胶 过滤，液相色 谱，亲和色谱和超滤等方法。 分离纯化过程的评价：A: 纯化倍数：每一步所得的比活力与第一步的比活力之比
22、值，起始时定为 1。B：回收率：每一步所得的总活力与第一步的总活力之比值。C: 酶的纯度越高，比活力越高，纯化倍数越高，回收率降低。二、酶的活力与测定： 基本概念：1、 酶活力：又称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度表示。2、 酶活力单位：最适条件下一定时间内催化完成一定化学反应所需要的酶量，不同的酶往往采取不同的测定方法，因此活力单位也不尽相同。3、 国际单位：指在最适条件下，每分钟催化 1mol/L 底物减少或 1mol/L 产物生成所需的酶量，温度一般为 25，表示为 IU。4、 催量(katal): 指在一定条件下 1 秒钟内转化 1mol
23、底物所需的酶量，1 katal=6*107IU。5、 比活力：也称比活性，指每 mg 酶蛋白所具有的活力单位，是表示酶制剂纯度的一个重要指标，比活力越大，纯度越高。6、 转换数：单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。（二） 、酶活力测定1、基本原理：A：酶蛋白结构复杂、种类多，一般对酶的测定不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力。B：当底物浓度过量时，在酶促反应的初始阶段，其反应速度与酶浓度成正比。C：酶活力测定即为测定化学反应的速度。2、酶活力测定的主要流程和方法：主要流程：一方面可利用在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止
24、反应，测定在这一时间间隔内的化学反应量（初速度） 。另一方面可利用在一定条件下，加入一定量底物，在加入适量酶液，测得完成该反应所需的时间（平均速度） 。方法：光谱分析法，化学法,放射性化学法等注意事项：A：计时准确；B：预热温度完全；C：到时间应立即终止反应；D：注意稀释第六节 重要的酶类一、多酶体系：1、什么是多酶体系？在一个完整细胞的某一代谢过程中，有几个酶组成的反应链体系。2、什么是限速步骤？多酶体系反应的总速度决定于其中反应速度最慢的那一步反应，这一步反应称为限速步骤。*大部分多酶体系的第一步反应就是限速步骤，多为反应终产物抑制。3、顺序反遗抑制二、别构酶（酶的别构效应） （一） 、什
25、么是别构酶及其组成？ 催化第一步反应的酶或交叉处的酶。它包括活性中心和别构中心，活性中心负责对底物的结合和催化，别构中心可结合调节物，负责调节酶促反应的速度。（二） 、什么是别构效应？调节物：也称效应物，一般指的是酶的底物或底物类似物或代谢的终产物。别构效应：调节物与别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度及代谢过程，这种效应称为别构效应（酶和一个配体（底物或调节物）结合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力） 。效应物分为正效应物和负效应物。正效应物：指效应物的结合使酶活性升高，也称别构激活剂。负效应物: 指效应物的
26、结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。（三） 、别构效应的种类：1、根据配体性质分：配体相同时为同促效应：当一个效应物与酶结合后，影响另一相同的效应物与酶的结合。配体不同时为异促效应：当一个效应物与酶结合后，影响另一不同效应物与酶另一部分结合。2、协同效应：一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应物分子的结合产生影响，这种效应为协同效应。正协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，有利于后续底物分子或调节物分子的结合。负协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，不利于后续底物分子或调节物分子的结合。（四） 、别构酶特点1、 含多个亚基组成，有催化部位和调节部位；2
27、、 具有别构效应；3、 动力学曲线不符合米式方程的双曲线，非别构酶表现为双曲线（典型的米式方程曲线） ，正协同效应酶表现为 S 型曲线，特点是对较小的底物浓度即作出灵敏应答；负协同效应酶表现为 S 型曲线，特点是对较小的底物浓度即作出灵敏应答。（五） 、别构酶的举例：天门冬氨酸转氨甲酰酶，简称 ATcase，催化反应为：氨甲酸磷酸+ASP+ATP 氨甲酰天门冬氨酸+HPO 42-+H+Atcase 由五个亚基组成，氨甲酸磷酸、ASP、ATP 为正协同效应，氨甲酰天门冬氨酸和 CTP 为负协同效应。（六） 、别构酶 S 型动力学曲线的解释1、 序变模型：KNF 模型，指当没有效应物存在时，别构酶
28、只有一种构象，即紧张态T，对底物的亲和力很小，当效应物与酶结合后，诱导 T 态转变为 R 态，形成 RT过渡态，使邻边的亚基产生 R 态，对底物亲和力增高。2、 齐变模型MWC，底物与别构酶亚基之一结合后，使该亚基从 T 态转变为 R 态，其他亚基也几乎同时转变为 R 态，不存在 TR 过渡态，对称性是齐变模型的主要特征。三、共价调节酶1、什么是共价调节酶？这是指一类在其他酶的作用下，其结构发生共价修饰，使其在活性形式或非活性形式之间相互转变的酶。2、特点: 都存在无活性和有活性两种形式，两者间的互变由不同酶催化。 大幅度放大反应的化学信号。3、举例：糖原磷酸化酶：磷酸化酶 a-活性形式四个亚
29、基组成的寡聚糖磷酸化酶 b非活性形式-二个亚基组成的寡聚糖4、主要类型：磷酸化/脱磷酸化、腺苷酸化/脱腺苷酸化、甲基化/脱甲基化等。四、同工酶1、什么是同工酶？指同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链组成的单体、纯聚体或杂交体，能催化相同的化学反应，但在理化性质或生物学性质方面存在明显差异的一组酶，一般由两种或两种以上的亚基组成。2、主要作用： 用于判断组织的代谢情况 可诊断组织是否发生病变3、举例：乳酸脱氢酶由 H 亚基和 M 亚基组成，催化乳酸脱氢生成丙酮酸。LDH1（H 4） 、LDH 2（H 3M） 、LDH 3（H 2M2） 、LDH 4（HM 3）和 LDH5（M 4）可用电泳方法分离。五、固定化酶固定化 酶是通过吸附、耦联、交 联和包埋等物理或化学的方法把酶连接到某种载体上，做成仍具有酶催化活性的水不溶性酶。作用特点： 稳定性提高，易分离，可反复使用，提高操作的机械 强度。
