醛脱氢酶基因敲除的K.doc

1、醛脱氢酶基因敲除的 K. pneumoniae重组菌的构建*中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2005, 25(12):3438张延平刘铭曹竹安*（清华大学化工系生物化工研究所北京 100084）摘要在利用 Klebsiella pneumoniae M5aL 厌氧发酵甘油生产 1,3 丙二醇的过程中，一部分甘油通过氧化代谢途径经醛脱氢酶（ALDH）催化合成大量副产物乙醇，降低了 1,3 丙二醇的产量和得率。首次以醛脱氢酶 ALDH 为改造目标，利用同源重组技术获得了 ALDH 基因敲除的 K. pneumoniae 重组菌。首先，采用 PCR 的方法分别从 K. p

2、neumoniae M5aL 基因组 DNA 及质粒 pBR322 上扩增得到 ALDH 基因和四环素抗性基因（Tcr） ；然后将 ALDH 基因定向插入到质粒 pUC18 的多克隆位点得到中间载体 pUC18ALDH ，该载体与 Tcr 基因分别用AvaI 和 BsaAI 双酶切后进行连接，得到 ALDH 基因敲除的重组载体 pUCAT；经 DNA 测序及限制性酶切电泳分析，构建的载体由 5ALDHTcr3ALDHpUC18 组成，与设计结果相符；最后，利用该载体通过同源重组技术得到两株 K. pneumoniae 重组菌 06231hb 及06231hc ，经菌落 PCR 及酶活鉴定，两株

3、菌的 ALDH 基因均已缺失。与出发菌株 K. pneumonaie M5aL 相比，重组菌的乙醇合成浓度降低了 43%53%，1,3 丙二醇合成浓度提高了 27%42%。关键词醛脱氢酶 1,3 丙二醇乙醇克氏肺炎杆菌基因敲除收稿日期：20050714 修回日期：20050922*国家“973”计划资助项目（2003CB716000）* 通讯作者，电子信箱：cza-1,3 丙二醇（1,3PD ）是一种重要的化工原料，其微生物生产方法在近年来受到重视，研究不断深入。但仍然存在着产物得率较低，生产成本较高等问题，制约了其工业化生产1 。本课题组在利用Klebsiella pneumoniae M5

4、aL 厌氧代谢合成 1,3PD 的研究中发现，导致 1,3PD 得率下降的主要原因是大量副产物乙醇的生成2,3 。醛脱氢酶是 K. pneumoniae M5aL 厌氧转化甘油合成乙醇的重要酶4 ，其催化作用导致发酵体系中乙醇大量积累，影响了目的产物1,3PD 的合成。通过基因敲除的方法阻断乙醇代谢途径，使 K. pneumoniae M5aL 的甘油代谢转向 1,3PD 途径，有利于 1,3PD 的合成。本文通过在 ALDH 基因中插入四环素抗性基因（Tcr）的方法，利用同源重组技术构建了 ALDH 基因敲除的 K. pneumoniae 重组菌。1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 主要

5、酶和试剂四环素盐酸盐购自 Sigma 公司；限制性内切酶，包括EcoRI，HindIII，AvaI 及 BsaAI 等均购自宝生物工程有限公司或 NEB 公司。PCR 相关试剂购自宝生物工程有限公司，其它试剂购自北京市科海军舟生物科技发展中心。1.1.2 菌株、质粒及培养基菌株、质粒及培养基见表 1。表 1 实验菌株和质粒Table 1Bacterial strains and plasmids菌株和质粒Strains and plasmids特征及基因型Properties and genotypes来源和参考Source and references 质粒 PlasmidspUC18Amp

6、r，2686bpLab collectionpUC18ALDH1445bp DNA fragment with ALDH gene in pUC18，Ampr，4080bpThis work(续表 1)pBR322Source of Tetracycline resistant gene，TetrLab collectionpUCAT1.65kb DNA fragment with Tetracycline resistant gene in the ALDH gene of pUC18ALDH ， Ampr，Tetr，5673bpThis workK. pneumoniae M5aLSour

7、ce of ALDH gene and host of homologous recombinationProvided by Prof. Li Jilun (Department of Microbiology and Immunology, China Agricultural University)E. coli DH5a)Host of pUC18ALDH and pUCATLab collectiona):E. coli DH5 培养基：LB；选择性培养基：LBT+，在 LB 培养基中添加适量的四环素2005, 25(12)张延平 等： 醛脱氢酶基因敲除的 K. pneumoniae

8、 重组菌的构建中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 20051.2 方法1.2.1ALDH 基因及 Tcr 基因的扩增采用 Omiga 软件，参照 GenBank 中的 ALDH 基因（AB106869）及 Tcr 基因（J01749） ，设计如下引物并由北京赛百胜基因技术有限公司（SBS）合成：A1：5 GTAGAATTCATGACAGCACCCGTTCAACAC3 （EcoRI） ；A2：5 GTCAAGCTTCAGGCCTGCAGATAGACCAC 3 （HindIII） ；P1：5ATCCTCGGGAGATCCAGTTCGATGTAAC3

9、（AvaI） ；P2：5TGTCACGTATCATTCAGGTCGAGGTG3 （BsaAI） 。其中 A1 和 A2 用来扩增 ALDH 基因序列，分别引入 EcoRI 和 HindIII 酶切位点。P1 和 P2 扩增 Tcr 基因，分别引入 AvaI 和 BsaAI 限制性内切酶识别位点，用来插入到 ALDH 基因中间使之被缺失。1.2.2 重组载体 pUCAT 和中间载体 pUC18ALDH 的构建图 1ALDH 基因敲除的载体构建的基本策略Fig. 1Strategy of vector construction forALDH gene knockoutALDH 基因敲除的重组质粒

10、的构建示意图见图 1。以 A1 和 A2 为引物，从 Klebsiella pneumoniae M5aL 基因组上扩增得到约 1.45kb 的 ALDH 基因片段。用 EcoRI 和 HindIII 双酶切该片段和 pUC18 质粒，将两者定向连接起来得到质粒 pUC18ALDH （即图 1 中质粒pUCA1） 。以 P1 和 P2 为引物从质粒 pBR322 上扩增得到约 1.65kb 的 Tcr 基因片段，用 AvaI和 BsaAI 双酶切后插入到质粒 pUC18ALDH 上 ALDH 基因的 AvaI 和 BsaAI 酶切位点之间，得到 ALDH 基因敲除的重组载体 pUCAT。质粒用

11、质粒纯化试剂盒（北京赛百盛基因技术有限公司产品）提取。分子生物学操作见文献5 。1.2.3 同源重组构建 ALDH 基因缺失的 K. pneumoniae 重组菌以 A1 和 A2 为引物从重组载体pUCAT 扩增长度约 3.1kb 的 DNA 片段 5ALDHTcr3ALDH ，参照分子克隆实验指南的方法，将得到的 DNA 片段纯化后转化感受态细胞 K. pneumoniae M5aL，涂布于四环素抗性筛选平板，筛选同源双交换的抗性菌株。1.2.4 重组菌 ALDH 酶活鉴定细胞粗酶液的制备采用超声破碎的方法：收集发酵液经 13 000r/min，4离心 2min 后弃去上清液，将菌泥用适量

12、预冷的 50mmol/L 甘氨酸/NaOH 缓冲液（pH 9.5）洗涤后再次离心。将菌泥用 58ml 50mmol/L 甘氨酸/NaOH 缓冲液（pH 9.5）重悬后进行超声破碎，经(3s+3s)99 次超声后的细胞破碎液经 13 000r/min，4离心20min，所得上清液即可用于 ALDH 酶活测定。根据文献6 ，对细胞粗酶液测 ALDH 酶活可利用其逆反应，通过测定吸收峰在 340nm 处的NADH 的增量进行换算：Acetaldehyde+CoA-SH+NAD+Acetyl-CoA+NADH。在 50mmol/L 甘氨酸/NaOH 缓冲液（pH 9.5）中加入 2mmol/L 乙醛（

13、Acetaldehyde） ，0.2mmol/L CoASH ，0.8mmol/L NAD+，30反应 1020min。NADH 的摩尔吸光度为：340=6220M-1cm-1。每 min 产生 1mol NADH 的蛋白量定义为 1U。蛋白浓度测定用考马斯亮蓝法7 。2 结果 2.1ALDH 及 Tcr 基因扩增和鉴定以 K. pneumoniae M5aL 基因组为模板， A1 和 A2 为引物扩增 ALDH 基因，PCR 产物经 0.7%琼脂糖电泳，得到了约 1.45kb 的特异条带（见图 2a） ，经酶切电泳分析初步确定该条带为ALDH 基因。以 pBR322 为模板，P1 和 P2

14、为引物扩增得到 1.65kb 的四环素抗性基因（Tcr）（见图 2b） 。图 2PCR 扩增得到的 ALDH 基因及 Tcr 基因1: ALDH 基因; 2: Tcr 基因; M1, M2: DNA MarkerFig. 2Identification of ALDH gene andTcr gene produced by PCR1: ALDH gene; 2: Tcr gene; M1:DNA Marker DL2000;M2: DNA Marker DGL4000图 3 质粒 pUC18ALDH 的基本结构及酶切鉴定(a)：pUC18ALDH 的基本结构；(b)：pUC18ALDH 限制

15、性内切酶酶切电泳结果;1: pUC18ALDH 经 BamHI 酶切为 4.1kb 线性片段; 2: pUC18ALDH; 3: pUC18ALDH 经 PvuII 酶切为 2.3kb,1.2kb 及 0.5kb DNA 片段; M: DNA marker DGL4 000Fig. 3Structure and identification of vectorpUC18ALDH(a): The structure of vector pUC18ALDH; (b): The identification of vector pUC18ALDH by digestion；1: pUC18ALDH

16、was digested by BamHI to 4.1kb linear vector; 2: pUC18ALDH; 3: pUC18ALDH was digested by PvuII to 2.3kb, 1.2kb and 0.5kb fragments; M: DNA marker DGL40002.2 中间载体 pUC18ALDH 的构建及鉴定中间载体 pUC18ALDH 的基本结构如图 3(a)（pUCA1）所示，经 BamHI 及 PvuII 分别酶切的电泳图谱如图 3(b)所示，其结构正确无误。进一步利用 pUC18/M13 上下游通用引物测定该质粒中外源片段的序列，双向测序后

17、拼接得到一条 1 440bp 长的核苷酸序列，通过与GenBank 报导的 K. pneumoniae ALDH 基因比较，鉴定为正确的克隆及载体。2.3ALDH 基因敲除的重组载体 pUCAT 的构建及鉴定目标载体 pUCAT 由 5ALDHTcr3ALDHpUC18 构成见图 4(a)，经HindIII，HindIIIEcoRI ，PstI 及 PstIScaI 分别酶切的电泳图谱如图 4(b)所示，其结果与设计的结构相符。图 4ALDH 基因敲除的载体 pUCAT 的基本结构及酶切鉴定(a)：目标载体 pUCAT 的基本结构；(b)：目标载体 pUCAT 限制性内切酶酶切电泳结果;1:

18、目标载体 pUCAT 经 HindIII 酶切为 3.9kb 及 1.8kb DNA 片段;2: 载体 pUCAT 经EcoRIHindIII 双酶切为 2.6kb, 1.8kb 及 1.2kb DNA 片段; 3: 载体 pUCAT 经 PstI 酶切为 5.7kb 片段; 4: 载体 pUCAT 经 PstIScaI 双酶切为 4.8kb 及0.9kb DNA 片段; M1: DNA Marker DGL15000; M2: DNA Marker D0162Fig. 4Structure and identification of vector pUCAT for ALDH gene kn

19、ockout(a): The structure of the targeting vector pUCAT; (b): The identification of vector pUCAT by digestion；1: The targeting vector was digested by HindIII to 3.9kb and 1.8kb fragments;2: The targeting vector was digested by EcoRIHindIII to 2.6kb, 1.8kb and 1.2kb fragments; 3: The targeting vector

20、was digested by PstI to 5.7kb linear vector; 4: The targeting vector was digested by PstIScaI to 4.8kb and 0.9kb fragments; M1: DNA Marker DGL15000;M2: DNA Marker D01622.4ALDH 基因缺失的 K. pneumoniae 菌的构建及鉴定经过反复的抗性筛选和纯化，得到 2 株菌 06231hb 和 06231hc ，对这两株菌进行菌落PCR（引物采用 A1 和 A2） ，如图 5 所示，均得到 3.1kb 的唯一的 DNA 片段

21、。酶切检验结果表明，该 DNA 片段由 5ALDHTcr3ALDH 组成，与预期一致，可以初步认定06231hb 和 06231hc 是 ALDH 基因缺失的重组菌。图 5ALDH 基因缺失的 K. pneumoniae重组菌的基因水平鉴定C, 06231hc, 06231hb: 分别为 K. pneumoniae M5aL, 06231hc及 06231hb 菌落 PCR 结果; M: DNA Marker DGL 4 000Fig. 5Identification of recombinant K. pneumoniaestrains of ALDH gene knockout by co

22、lonyPCRC, 06231hc, 06231hb: colonyPCR products of K. pneumoniaeM5aL, 06231hc, 06231hb,respectively; M: DNAMarker DGL 4 000对这两主菌进行 ALDH 酶活测定，也达到预期效果。如图 6 所示，重组菌 06231hb 及06231hc 基本检测不到 ALDH 酶活，与出发菌株 K. pneumoniae M5aL（0.181 U/g protein）相比，两株重组菌的残余 ALDH 比酶活均在 02%的实验误差范围内，说明两株菌的 ALDH 基因确已敲除。图 6 重组菌 062

23、31hb 及 06231hc 的 ALDH 比酶活Fig.6Identification of recombinant strains 06231hb and 06231hc by ALDH activity assay初步研究结果表明，与出发菌株 K. pneumoniae M5aL 相比，厌氧代谢甘油时重组菌06231hb 及 06231hc 合成的 1,3PD 浓度分别提高了 27.1%和 42.4%，而乙醇合成浓度分别下降了 53.1%和 42.7%（见图 7 所示） 。图 7 重组菌 06231hb 及 06231hc 与原始菌K. pneumoniae M5aL 的 1,3 丙二醇

24、及乙醇合成曲线Fig. 7Curves of 1,3PD and ethanol biosynthesis by06231hb, 06231hc and K. pneumoniae M5aL以上结果表明，利用同源重组技术构建 ALDH 基因敲除的重组菌，对提高 1,3PD 产量和减少副产物合成是切实可行的。3 讨论本文构建了 ALDH 基因敲除的载体 pUCAT，由 5ALDHTcr3ALDHpUC18 组成，经 DNA 测序及限制性酶切电泳分析，构建的载体与设计的结构相符。利用该载体，通过同源重组技术成功构建了 ALDH 基因缺失的 K. pneumoniae 重组菌 06231hb 及 0

25、6231hc ，菌落 PCR 鉴定及 ALDH 酶活测定结果表明，这两株重组菌的 ALDH 基因完全敲除。厌氧发酵结果表明，重组菌 06231hb 及 06231hc 的 1,3PD 合成浓度分别比出发菌株 K. pneumoniae M5aL 提高了 27.1%和 42.4%，而乙醇合成浓度分别下降了 53.1%和 42.7%。参考文献1 AbbadAndaloussi S, ManginotDurr C, Amine J, et al. Isolation and chaeacterization of clostridium butyricum DSM 5431 mutants with

26、 increased Resistance to 1,3propanediol and altered production of acids. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(12): 441344172 杜晨宇, 李春, 杨东, 等. Klebsiella pneumoniae 合成 1,3 丙二醇过程中的生长与催化耦联. 化工学报, 2004, 55(3): 505508Du CH Y, Li CH, Yang D, et al. Journal of Chemical Industry and Engineering,

27、2004, 55(3): 5055083 张延平, 杜晨宇, 饶治, 等. 维生素 C 和 E 对 Klebsiella pneumoniae 合成 1,3丙二醇的调控. 过程工程学报, 2005, 5(2): 197200Zhang Y P, Du CH Y, Rao ZH, et al. The Chinese Journal of Process Engineering, 2005, 5(2): 1972004 Zeng A P, Biebl H, Schlieker H, et al. Pathway analysis of glycerol fermentation by Klebs

28、iella pneumoniae: regulation of reducing equivalent balance and product formation. Enzyme and Microbial Technology, 1993, 15: 7707795 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. 分子克隆实验指南.第 2 版. 北京: 科学出版社, 1993. 3469Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning a Laboratory Manual. 2nd ed. Beijing:

29、 Science Press, 1993. 34696 Lidya B. Aldehyde dehydrogenase (CoAacetylating) and the mechanism of ethanol formation in the Amitochondriate protist, Giardia lamblia. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1998, 354(1): 57647 余冰宾. 生物化学实验指南. 北京: 清华大学出版社, 2004. 13638Yu B B. A Laboratory Manual on Bioc

30、hemistry. Beijing: Tsinghua University Press, 2004. 136138Construction of K. pneumoniae Recombinants ofAldehyde Dehydrogenase Gene KnockoutZHANG YanpingLIU MingCAO Zhuan(Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering, Tsinghua UniversityBeijing100084, China)AbstractGlycerol

31、 can be transformed to 1,3propanediol (1,3PD) by Klebsiella pneumoniae attending by ethanol accumulation. Aldehyde dehydrogenase (ALDH) is the first enzyme for biosynthesis of ethanol, which competes for reducing equivalents NADH with 1,3PD dehydrogenase which catalyzes the biosynthesis of 1,3PD. Fo

32、r the first time ALDH gene of K. pneumoniae was disrupted. A homologous recombination vector pUCAT was constructed, in which ALDH gene was disrupted by inserting tetracycline resistant (Tcr) gene. As expected, the vector was proved to be consisted of 5ALDHTcr3ALDHpUC18. The amplified DNA fragment of

33、 5ALDHTcr3ALDH from pUCAT was used to transform K. pneumoniae M5aL and 2 recombinants were obtained. From results of colonyPCR and ALDH activity assay, it was indicated that in both recombinant 06231hb and 06231hc the ALDH gene was disrupted completely. Comparing with those of the wild type K. pneumoniae M5aL, yields of ethanol of recombinants were decreased by 43%53% and yields of 1,3PD were increased by 27%42%. Key wordsAldehyde dehydrogenase1,3PropanediolEthanolKlebsiella pneumoniaeGene knockout