1、1、 测定血脑屏障完整性原理伊文思蓝属于一种常用的偶氮染料制剂,因其分子量大小与血浆白蛋白相近，而且在血液中与血浆白蛋白有很高的亲和力，由于正常状态下血浆白蛋白无法透过血脑屏障，所以染色时，如神经系统是完整的，与血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。相反如果神经系统血脑屏障被破坏，依文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。在荧光波长 470 与540 nm 各有一强峰，680 nm 处有一弱峰。其在组织中的含量常使用化学透析法和比色法进行检测。脑组织中血脑屏障的破坏，可以引起毛细血管的通透性增加，结合 EB 的白蛋白可通过BBB 进入脑组织，应用化学比色法甲酰胺测定脑组织 EB 渗出量，可以反映血
2、脑屏障的开放程度，并在此基础上进一步探讨不同细胞移植干预与 BBB 通透性的效应关系。伊文思蓝灌注染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察脑切片中 EB 荧光强度，可以检测血脑屏障中血管形态的改变，同时对脑组织中渗入的 EB 含量进行定量分析。两者结合可以从形态学、组织定量上相互补充完善。2、实验准备试剂：2%EB、1%戊巴比妥钠、0.9%氯化钠、20U/ml 肝素钠、 二甲基甲酰胺器材：冰冻切片机、共聚焦激光扫描显微镜、分光光度计、恒温箱、离心机、注射器、输液器、解剖器械等3、测定方法1、 各组动物处死前 0.5h（也有的为 1h、2h ）尾静脉（或股静脉）注入 2%EB（2ml/kg，也有的用
3、3、4ml/kg）（剂量与提前时间成反比？）2、 1%戊巴比妥钠 30-40 mg/kg 麻醉后打开胸腔，心内灌注肝素生理盐水（0.9%氯化钠+20U/ml 肝素钠）200-300ml（有文献提出当右心房流出液体变清澈时即可停止灌注），断头取脑作矢状切取半脑分离海马，一半脑组织进行冰冻切片，应用冰冻切片机行 10-20 m 切片，于共聚焦激光扫描显微镜下观察 EB 通透情况。3、 另一半脑组织称重，剪碎置于 二甲基甲酰胺（1ml/100mg 脑组织，也可用三氯乙酸、甲酰胺）60孵育 24h，1000r/min 离心 5min（有的作者认为脑组织在甲酰胺中匀浆呈胶状，上清液不能通过离心取得，水浴后直接取上清液比色），用分光光度计检测波长为 620 nm的吸光度。4、 采用软件（Oringen7.0）进行数据分析，根据绘制的 EB 标准曲线计算 EB 含量。4、试剂购买EB二甲基甲酰胺
