1、常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。氨甲喋呤（MIT）与 -半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、58mg MIT 用 0.1ml 二甲基甲酰胺溶解，冷却至 10 度，加 2ul 氯甲酸异丁酯，10 度搅拌反应 30 分钟。2、1.5mg 酶用 2ml 50 m mol/L Na2CO3 溶解。3、10 度反应 4 小时（必要时加
2、 NaOH,以维持溶液的 pH 为 9.0，q 然后 4 度过夜。4、过 sephadex G-25 层析柱，柱用含 NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L 的 50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含 BSA 0.1（w/v） 、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。碳化二亚胺法制备 3,3,5-三碘甲腺氨酸- 血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、 取 EDC 100mg , 用 pH8.0 的 10 m mol/L PBS 液 2.5ml 使之充分溶解（I 液）2
3、、 取 3，3,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用 0.2mol/L NaOH 溶液 2ml 溶解(II 液)3、 取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于 10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III 液）4、 将 II 液与 III 液混合，在磁力搅拌下逐滴加入 I 液（余下 0.5ml）5、 室温下避光搅拌 1 小时，逐滴加入余下的 I 液6、 4 度搅拌 12 小时7、 静置 10 小时（4 度）8、 有蒸馏水使之充分透析（约 48 小时） ，得免疫原。孕酮与与 -半乳糖苷酶偶联的 N-羟琥珀酰亚胺酯法1、 用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配
4、成浓度为 100m mol/L 的溶液。2、 加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺） ，200 m mol/L, 4 度反应 16 小时。3、 用簿层扫描方法纯化(氯仿：水 =9：1)4、 按孕酮/酶摩尔浓度比约为 10 的比例，将上述溶液加入到酶液（用 pH7.4，浓度 50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤1、 用 0.1 mol/L HCl 溶液配制 4 m mol/L 浓度的半抗原。2、 滴加 1NaNO2(过量)，
5、4 度持续搅拌。NaNO2 的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加 1淀粉和 50m mol/L KI 进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。3、 溶液变成蓝黑色后，继续反应 15 分钟。4、 用 pH9.0、浓度为 200m mol/L 的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。5、 边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象） ，调节 pH 到 9.5。6、 冰箱中搅拌反应 2 小时，不断调节 pH 到 9.0。7、 用 PBS 透析 2 天8、 -20 度保存（浓度为 20mg/mL）双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。例如
6、：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与 -半乳糖苷酶偶联。应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与 -半乳糖苷酶标记特的操作步骤1、 用含 5（W/V）N- 乙基吗啉的无水甲醇 0.4ml,在室温下溶解 570ug 去甲基三正喋呤和 488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A 液)2、 取与 -半乳糖苷酶 100 ug, 溶于 pH9.9 的 100 m mol/L 碳酸缓冲液（含 MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇 10 m mol/
7、L 0.1ml(B 液)3、 将 A 液倒入 B 液。4、 20 度反应 90 分钟后，加含 NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L 和 2-巯基乙醇 10 m mol/L、pH7.5 的 Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。5、 过 sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约 75的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline ) 进行偶联，则只有 15的酶与之结合。（三）含巯基半抗原的偶联可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamid
8、e)激活。或将载体蛋白与半抗原在 pH4.0 的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。（四）含羟基的半抗原偶联醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐 (succinic anhydride)和 8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用 100 ml 乙酰乙酯溶解。2、 加热回流 1 小时。3、 减压蒸馏去溶剂，,残余物用 5% NaHCO3 水溶液溶解。4、 用乙醚洗涤两次，然后用 H2SO4 进行 s 酸化（pH 到 2.0）.5、
9、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75，熔点 88-89 度）6、 取 2.5g 半琥珀酸酯溶于 6.5ml 亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65 度加热 30 分钟。7、 减压蒸发，干燥 1 小时（高度真空条件下） 。8、 将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于 15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应 2 小时。9、 65 度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶-5-酯约 84，熔点160 度） 。10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得
10、 f 半抗原- 半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化） 。半抗原用 NaIO4 氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤1、 20mg 腺苷溶于 1ml 100m mol/L NaIO4 溶液中，4 度避光反应 30 分钟。2、 加 1 滴乙二醇(得 A 液)3、 将 A 液加入到 -半乳糖苷酶液（20mg/ml,用 150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2 水溶液溶解，用 3K2CO3 调节 pH 至 9.0）中4、 4 度反应 2 小时，期间不断调节 pH9.05、 加入临时配制的 50 mg/ml NaBO4 溶液，用量为反应体积的 1/10
11、。 4 度反应过夜。6、 用含有 MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇 10 m mol/L、 NaCl 100 m mol/L 的 50 m mol/L磷酸缓冲液(pH7.4) 透析(更换透析液数次)（五）含酮基或酮基半抗原的偶联是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸 aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺 carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤1、 在 200ml 乙醇中，加入 O-(羧甲基)羟胺
12、（O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为 10m mol/L 和 4m mol/L2、 加热回流 90 分钟3、 旋转蒸发，减少容积，然后加水至 40ml，用乙醚抽提4、 用水洗涤乙醚抽提物，用 Na2SO4 干燥成白色粉末。（六） 、其他半抗原的偶联虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直接用来与载体蛋白 偶联。制备雌二醇-6-肟的操作步骤a、 雌二醇二醋酸盐的制备1、 1g 雌二醇溶于 14ml 吡啶及 3.5ml 醋酐中2、 加热回流 1 小时，冷却后倾入冰水中。3、 收集白色晶体，得产物约 1.1g（熔点 126 到 1
13、27 度）b、 雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备4、雌二醇二醋酸盐 1.1g，滴加冰醋酸 3.8ml 溶解后加含 0.93g CrO3 的含水冰醋酸 6.35ml (H2O:Hac=0.75:5.6)5、室温搅拌 1 小时，静置 24 小时6、用水稀释，用乙醚提取 4 次7、用蒸馏水洗 2 次8、减压蒸馏，得结晶油状渣物。9、用 90 度烘干 20 分钟，得粗制品约 500mg10、用 11ml 无水乙醇溶解粗制品，再加 1.1ml 冰醋酸及 1.5g 吉纳你特 T 试剂(Girad T)，回流 1 小时。11、冷却后，用冰致冷的蒸馏水稀释，用 2.5mol/LNaOH 调节 pH 至 6.0-
14、6.2.12、用乙醚抽提 3 次，弃去乙醚。13、水层用浓盐酸酸化（盐酸终浓度为 1mol/L).14、室温静置 2 小时。15、用乙醚抽提 3 次。16、合并乙醚抽提液，用 0.125mol/L 碳酸钠溶液洗 1 次，用蒸馏水洗 3 次。17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。18、加 7ml 醋酐，回流 20 分钟。19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约 176mg (熔点为 162-166度)c、 二醇-6-酮的制备20、用 5.5ml 20的氢氧化钾 -甲醇溶液(W/V) 溶解雌二醇 -6-酮-二醋酸盐（176mg）,在室温下于氮气中水解 24 小时。21、加蒸馏水稀释，用乙
15、醚抽提 3 次。22、在乙醚提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约 60mg(熔点为 278-282 度)d、 雌二醇-6-肟的制备23、取雌二醇-6-酮 50mg ,盐酸羧甲基羧胺 50mg,溶于 20含水甲醇(V/V)7ml 和 1mol/L醋酸钠 4ml 中，回流 1.5 小时。24、减压、蒸馏、浓缩后，加蒸馏水 20ml25、用 2 mol/L NaOH 调节 pH 至 8.5。26、用醋酸乙酯抽提 4 次27、水层用 1 mol/L 盐酸酸化至 pH2.5。28、用醋酸乙酯抽提 4 次29、合并抽提液，蒸干，得产物约 100mg(结晶熔点约 186-188 度) 其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。
