1、一、感受态细胞 XL-1 转化实验（1）5ngDNA+100l 感受态细胞 XL-1 于 1.5ml 离心管中 ,混匀，冰浴 30min。（2）42 oC, 45s。（3）冰浴 2min。（4）涂布于固体 LB 平板上(含 50mg/ml 氨苄青霉素 , 37 oC 预热) 。（5）放入 37 oC 恒温孵育箱，待液体吸收完全后，倒置孵育 16-18h。（6）保鲜袋密封后，倒置放于 4oC 冰箱保存。二、菌液的培养与质粒的提取1.每个样本挑取 5 个细菌，进行摇菌，提取质粒。 （一个细菌一支管）在 50ml 离心管里加入 5ml 液体 LB 和 5l 50mg/ml 氨苄青霉素，用200l 枪
2、头挑取过夜培养 LB 平板上的单克隆，枪头打入离心管中，置于37oC 摇床， 250r/min 培养 1618h，质粒提取。 （老师，这里要先挑取一个细菌进行摇菌后再分成五支离心管重新摇菌，还是直接挑取 5 个菌落直接摇菌）质粒提取(采用天根质粒小量多次提取试剂盒提取，步骤如下)：（1） 吸附柱中加入 500l 平衡液 BL，13000rpm 离心 1min。倒掉收集管中废液，吸附柱放回收集管，备用。（2） 收集 5ml 菌液，13000rpm/min, 离心 10min，收集沉淀。（3） 加入 500l 溶液 P1(含 RNase A), 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。（4） 加入 5
3、00l 溶液 P2, 温和地上下翻转 68 次，使菌体充分裂解。（5） 加入 700l 溶液 P3, 立即温和地上下翻转 68 次，充分混匀，此时会出现白色沉淀。（6） 13000rpm/min 离心 10min，收集上清分次加入过滤柱中(800l/次)。（7） 13000rpm 离心 2min 后将上一步得到的滤液分次加入吸附柱中(800l) 。（8） 13000rpm 离心 1min，弃掉滤液。（9） 加入 500l 去蛋白液 PD, 13000rpm/min 离心 1min 后弃滤液。（10）加入 600l 漂洗液 PW, 静置 5min, 13000rpm/min 离心 1min 后弃
4、滤液。（11）重复步骤 10。（12）13000rpm/min 离心 2min，彻底去除柱子中残留废液。（13）将 DNA 吸附柱放入新的离心管，悬空滴加 100l 无菌双蒸水，静置5min。13000rpm/min 离心 1min，所得到的液体即为高纯度的 DNA 溶液，置于-20 oC 保存。七定点突变的鉴定质粒提取后用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.1.6 亚克隆对成功突变的突变体和质粒载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒步骤回收载体和目的片段，用 T4 连接酶进行目的片段和表达载体的连接，产物转化细菌感受态细胞，挑取阳性克隆，按照质粒试剂盒说明书提取质粒，用限制性内切酶进行酶切鉴定，送质粒进行测序鉴定。
