1、几 种常用特殊染色操作要点 徐开军 云南省第三人民医院病理科 2 一、病原微生物： 真菌（PAS、GMS）、抗酸杆菌（苯酚碱性品红）、幽门螺 杆菌（W-S、硼酸亚甲蓝、碱性品红）、乙肝病毒（地衣红、 维多利亚蓝） 二、结缔组织： 胶原纤维 （VG 、Masson ） 、 网状纤维 （ 氢氧化银氨法） 、 弹力纤维（维多利亚蓝、醛品红品红）、 三、肌组织： 横纹肌（PTAH）、早期心肌病变（变色酸亮绿、HBFP） 目 前常用特 殊染色包 括几类： 3 四、淀粉样物 刚果红法（甲醇刚果红、碱性刚果红）、甲基紫法 五、色素 含铁血黄素（Perls）、黑色素（Masson-Fontana）铜（罗 丹明
2、、红氨酸） 六、糖类物质 糖原（PAS）、黏液物质（AB-PAS、AB） 七、脂内物质 中性脂肪（苏丹、油红O） 4 八、神经组织 尼氏体（硫瑾、甲苯胺蓝）、神经髓鞘（变色酸2R、砂罗 铬花青） 九、肝脏穿刺 Masson、网状纤维、含铁血黄素、PAS、铜等。 十、肾脏穿刺组织 Masson、六胺银、PAS、刚果红等 5 一 、网状 纤维染 色 氢 氧化银 氨法（Gomori法） 6 较 细的纤维 组织、短 、分支多 ，交织成 网状 （与胶原纤维共同为细胞丰富的器官起到支撑作用） HE呈淡红色 ，银氨液 浸染、甲 醛还原后 呈黑色 （嗜银性/嗜银纤维：黑色） 主 要由型 胶原蛋白 构成，表 面
3、被覆糖 蛋白 （PAS染色：淡紫红色） （一） 网状纤 维的形 态结构 7 染色方法有十余种： （Gomori、Gordon-Sweet、James、Foot、改良Lillie） 不同点： 1.所用氧化剂/浓度（KMnO 4 / 高碘酸 ；0.25% 、0.5% ）不同。 2. 所用银氨液（ 氢氧化银氨、 硝酸银氨、 碳酸银氨等） 不同。 每 种银氨液都处于离子状态， 离解成带正电荷的Ag （NH 3 ） 2 + （二氨合 银离 子） 和带有 负电荷的NO 3 - 、CO 3 2- 、CH 3 COO - 、OH - 等 。 3.背景复染不同：VG复染、核固红、不复染。 （二） 网状纤 维染色
4、 方法的 选择 8 经氧化 ， 网状纤维表面被覆糖蛋白中己糖毗邻的羟基转变为醛基 ， 银 氨液 （二氨合 银离子 ） 被 组织吸附后 并与醛基结合 ，经甲醛 还原、水 洗后 剩余的银 离子 还原为黑 色的 金属银而 沉淀 。 1. 氧化 （KMnO 4 ）：使网状 纤 维内羟基 转变 为醛基。 2. 漂白 （H 2 C 2 O 4 ）：棕色变 为无色。 3. 媒染 （铁 明矾 ） ：增加网 状纤维对 银氨 液的选择 性。 4. 浸银 （ 氢氧化银氨） ：银氨液中Ag （NH 3 ） 2+ 被 组织吸附 后 与 醛 基结合 。 5. 还原 （甲醛 ） ： 与网状纤维结合的 银氨配位化合 物还原成
5、黑色 的金属 银。 （三） 网状纤 维染色 原理 9 1. 高锰酸钾：强氧化剂 ， 具腐蚀 、 刺激性 。 在酸性溶液 （ 氧化力最强） 易分解（ 光有 催化作用 ）， 在实验室 用棕 色瓶存放 。 2. 草酸： 有毒 性、腐蚀 、刺 激性及很 强的 还原性。 （还 原剂和漂白剂） 3. 硫酸铁铵/ 铁明矾：易吸湿。 对光敏感。 在水中溶解缓慢 。 （ 媒染剂） 4.Gomori 银氨/ 氢氧化银氨：硝酸银、 氢氧化钾、 氢氧化铵。 （ 密封保存） 硝 酸银：氧化性 较强。 遇有机 物（ 沾上皮肤 ） 变灰黑色。 常 因纯度 不 高 被 保存于 棕色瓶 。 与部分有机 物或硫、 磷混合 研磨、
6、 撞击可 引起爆炸。 氢氧化 钾： 呈强碱性 及具 有腐蚀性 。极 易吸收空 气中 水分而潮 解。 氢 氧化铵：不稳 定， 易分解而 生成氨和水。 具有挥发性， 应密封保 存 在棕色瓶 中。 （四） 染色化 学试剂 选择 10 0.25% 高 锰酸钾： （定期 更换 ） 2% 草酸： 2% 硫酸铁 铵 ： Gomori 银 氨液 ：（ 使用、 保存 几周） （染色成败的关键） 4% 中性甲 醛 ：（ 定期 更换） （五） 染液的 配制及 保存 棕色瓶 2-8C冰箱保存 11 Gomori银氨液-1 10% 硝 酸银(3ml)+10% 氢氧化 钾(1ml) 蒸馏 水，洗涤沉淀（50-100ml蒸
7、馏水） 留 下沉淀 及少 许上清 液（4ml ） 逐滴 氢氧化铵（一次1-2滴加入） 至 沉淀逐 渐完 全溶解 逐滴10%硝酸银，至刚出现浑浊 加氢氧化铵一至数滴，使沉淀消失 蒸馏水 至40ml ，2-8C冰箱 12 Gomori银氨液-2 甲 液：硝 酸银(10.2g)+ 蒸 馏水100ml 乙 液：氢 氧化 钠（3.1g ）+ 蒸 馏水100ml 甲液 （5ml）+ 乙液 （5ml ） 逐滴 氢 氧化铵（一次1-2滴加入） 至 沉淀逐 渐完 全溶解 补加氢氧化铵（4滴） 蒸馏水 至50ml ，2-8C冰箱 13 染液配制中的注意事项 1. 配制染液玻璃容器必须清洁干净， 最好采用重铬酸钾清
8、洁液浸 泡过夜， 沥干洗液后再用自来水冲洗， 最后用蒸馏水冲洗2-3 次 。 2. 高锰酸钾浓度不宜超过1% （ 氧化速度过 快 后自身 易 被 氧化 ） 。 如 用酸性高锰酸钾 （ 加强氧化、 增强染色力） 氧化 ， 会 减弱银氨液对 细胞核的着染 ， 需复染胞核。 若 采用无色的氧化 剂 （ 高碘酸 ） 则 无 需漂白 的过 程。 3. 切片厚 度在3-4um （过 厚易造成 脱片 ） 。 4. 配制氢氧化银氨液： 硝酸银采用较高纯度级 （GR/AR ） ， 密封、 棕色瓶存储; 氢氧化钾干燥密封保存， 切勿使其潮解；氢氧化铵 使 用后密 封， 保持浓 度， 定期及 时更 换。 14 5.
9、 配制银 氨液 需使用 蒸馏 水/ 去离子水 ，以防 出现 银盐沉 淀。 6. 配制银氨液时， 所滴加氢氧化铵的量很关键， 边加边摇动至沉 淀 刚好溶 解。 7. 配好 的银氨 液对光 及空 气较为 敏感 （ 长时间暴 露在光/空气 作用后 均易离解而析出银盐沉淀） ， 应用棕色试剂瓶盛装并密封避光后置 于 冰箱 （2-8C ） 保存 。 （ 理论上保存 使用几周更换 ， 实际工作中 有 时可使用 更长 时间） 15 1、切片常规脱蜡至水。 2、0.25%高锰酸钾液氧化5min。自来水稍洗。 3、2%草酸液漂白1-2min。自来水充分洗，蒸馏水洗。 4、2%硫酸铁铵液媒染5min。自来水数秒，
10、蒸馏水稍洗。 5、Gomori银氨液作用30s-5min。蒸馏水稍洗。 6、4%甲醛液还原几秒-3min。自来水洗。 7、常规脱水透明，中性树胶封固。 （六） 染色流 程 16 染色过程中的注意事项 1. 网状纤维经 媒染和 浸 银染色后蒸馏水洗时间以数秒为佳 。 水洗 时间过长 ： 银的还原性减弱 （ 网状纤维不够黑） ； 时间过短 ： 银 的 还原性 不均 匀（着 色程 度不均 ）。 2. 染色中 的镜 下观察 ： 网状纤维经4% 甲醛还原， 自来水洗后显微镜下观察 。 如浸银不足 （ 网状纤维不够黑、 一般提示银氨液需要更换） ， 可在自来水洗 后 ， 再 滴加银氨液染色1-2min，
11、蒸馏水洗后4% 甲醛还原；如浸银 过度 ， 可用高锰酸钾液液稍处理 （ 对比不清晰） ， 再经自来水洗 。 可获得 一定 效果。 17 3. 高锰酸钾氧化时间不可过长， 过长容易影响组织细胞形态的观 察 。 4. 原法中甲醛还原后用0.2% 氯化金调色、5% 硫代硫酸钠固定及VG 液 复染， 实际 工作中 可省 略。（ 不进 行复染 结果 对比同 样清 晰） 5. 根据诊 断的 需要， 可进 行与其 他（ 如+Masson ） 染色套 染。 18 网状纤维黑色 胶原纤维黄色至棕黄色 胞核褐色 （七） 染色结 果 19 对照：可采用组织较小的肝脏穿刺组织 与其他染色共同应用 套染-Masosn+
12、Gomori 20 1.优质化学试剂的选择： 硝酸银、氢氧化钾/钠、氢氧化铵 2.合格的银氨液配制 （染色的关 键） ： 氨水的量 3.甲醛还原后的镜下控制： 深浅适宜 4.染液的保存期和配制的量： 2-8C冰箱保存、不宜多配、滴染。 1-6月（出现沉淀）更换 （八）小 结 做好 网状纤 维的要 素 21 二、抗酸染色 苯酚碱性 品红 法 （ Ziehl-Neelsen法） 22 抗酸染色是针对抗酸杆菌而言 ， 属分枝杆菌属 。 是一类细长略弯曲的杆菌 其 种类较多 ，有致病 性和非致 病性两类 。 引起人类疾病：结核杆菌、麻风杆菌、牛分枝杆菌 因 其本身的 特殊性 （菌壁中含不等量脂质） 一
13、般不易着色， 但一经着色后可抵抗酸类脱色（ 抗酸杆菌 ） 所致感染多为慢性感染过程， 长期迁延 ， 并有破 坏 性的组织 病变。 （一） 抗酸杆 菌的形 态结构 23 抗酸杆菌菌体胞壁上含有不等量的类脂质（ 磷脂 、 脂肪酸 、 蜡质D ） ， 并由糖脂形成一个蜡质的外壳 ， 它 能与苯酚碱性 品红结合形成复合物 ， 用盐酸酒精脱色能够抵抗酸的漂洗 。 因而抗酸杆菌呈红色。 （二） 抗酸杆 菌染色 原理 24 苯酚/ 石 碳酸： 无色 结晶，特殊 气味，呈 弱酸 性 ，时 间过 久/ 长 期暴 露在空 气受 到氧化 而 变成 粉红色 。有毒、 腐蚀 性， 常温下微溶于水 （ 熔点43C ） ，
14、 温度达60C 时 ， 能与水以 任何比例互溶。 碱性 品红 ：黄绿 色闪 光结晶 块状/ 暗 红色 粉末 ， 微溶 于水 （溶解度0.4% ） ，溶于酒 精（溶解度7.6% ） 。 （三） 染色化 学试剂 选择 25 5%苯酚水溶液：（临时配制） 先在恒温箱中加热溶解，吸取5ml与95ml蒸馏水混合配制。 苯酚碱性品红液：（保存期1年） 碱性品红 0.5-1g 无水乙醇 10ml 5%苯酚水溶液 90ml 苯酚作为媒染剂，可提高染液的染色性能，使碱性品红与抗酸杆菌牢固结合。 0.1%亚甲蓝液：（保存期1年） （四） 染液的 配制及 保存 溶解 （ 水浴加 热） 充分混合 过滤 2-8C冰箱保
15、存 26 染液配制中的注意事项 1.苯酚如呈红色 （受到 氧化） ，应 及时更换。 2. 碱性 品红 须选择 纯度 较高的 试剂 配制时 较难 溶解，应 注意 其溶解程度。 3. 因抗 酸杆 菌菌体 特殊 性， 可 在苯 酚碱性 品红 液内加 入适 当 的5%-10% 的Triton X-100或5%-10% 的Tween-20表面活性剂 （ 碱性品红酒精液10ml+5% 苯酚水溶液85ml+活性剂5ml ， 用前过滤） ， 来增加染液的渗透力 （易产生沉 淀） 。 4. 对于 脱钙 组织，强酸 脱钙可 能会 破坏抗 酸性 ， 最好 使用 弱 酸 （甲酸） 脱钙。 27 1、切片快速进行常规脱
16、蜡至水。 2 、 滴加苯酚碱性品红染液室温下染30min-60min （ 气温高低 调节） ，或 在恒温箱加热（立式染 缸） 染色15-20min。 3 、1% 盐酸酒精分化数秒 ， 至组织呈淡粉/ 无色 ， 自来水洗 。 4、0.1%亚甲蓝水溶液复染30s-2min，自来水洗。 5、快速梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 （五） 染色流 程 28 染色过程中的注意事项 1. 传统染色法采用酒精灯加热以缩短时间 （15-20min ） ， 其染色 结果相对不稳定。 室温中染色30-60min 能达到较好效果， 冬天 可 在立式 染缸 进行加 热 （60C ） 染色（20min） 。 2.
17、 盐酸酒 精分 化要适 度， 切片经 水洗 后应为 淡红/无色 为宜。 3. 亚甲蓝复染时间为30s-2min ， 避免过染 。 复染后迅速乙醇脱 水 ， 防止脱色过度 （ 过浅 对于坏 死组织 对比不 鲜明） 。 复染过 深或 过 浅都会 造成 对比不 清晰 。 4. 在苯酚碱性品红染色时和盐酸酒精分化步骤之间尽量不要使 得 切片干 燥。 29 5. 苯酚 碱性品 红有时 易出 现沉 淀 ， 染 色时 注意吸 取上 清液进行滴 染 。 6. 陈旧 病变中 的结 核杆菌 ， 染 色时着 色减 弱 ，有时 甚 至不能 显示 ， 染 色前先 用高 碘酸加 以氧 化可以 恢复 这些菌 的着 色性。
18、30 抗酸杆菌（结核杆菌和麻风杆菌）红色 胞核淡蓝色 （六） 染色结 果 结核杆菌 麻风杆菌 31 结合组织 学形 态特征以及 阳 性对照情 况来 判别。 32 结核杆菌：细长、稍弯曲，长短粗细不一，常单条散在分布， 多见于结核性干酪样坏死灶，在陈旧的病灶中，可 抗酸菌 呈颗粒状、短棒状等，在病理组织中有多形性变化。 麻风杆菌：较粗短、笔直，常呈束状排列或聚集成堆 结核杆菌 麻风杆菌 抗酸杆菌在退行性改变时可呈颗粒状，随后染色减弱甚至完全不着色。 33 1.化学试剂的选择： 苯酚：无色；碱性品红：质量优质。 2.染液的配制 （染色成 功的一半 ） ： 染液的配制是关键因素 3.对照的设立： 阳
19、性对照设立、保证结果的准确可靠 3.镜下的仔细观察： 尤为关键（有时常常存在几条杆菌） （七）小 结 做好 抗酸染 色要素 34 三、真菌染色 高碘酸-无色 品红法 （PAS 法） 35 真菌是一类真核细胞型微生物，种类繁多，分布极广。 对人体有致病性真菌和机会致病性真菌有上百种之多。 （一） 真菌的 形态结 构 真菌 单细胞 多细胞 酵母型真 菌 （ 新生隐球菌） 类酵母型真 菌（ 白假丝酵母 ） 呈圆形/椭 圆形 曲菌、白 色念 珠菌、 毛霉菌 菌体呈 丝状 ，并分枝 交织 成团 （ 基本上都是由菌丝和孢子组成） （按形态 、结构 分 类） 36 1.染色方法 高碘酸- 无色品红法 （PA
20、S ） 、 六胺银法（GMS ） 、 阿尔新蓝 法（AB（pH2.5）-新生隐球菌） 2.方法的实用性： PAS法（结果对比鲜明、操作简单、染液易保存） GMS法（结果对比鲜明、操作繁琐、染液复杂） AB法（应用于新生隐球菌的鉴别诊断） （二） 真菌染 色方法 的选择 37 利用各种真菌菌壁都含有多糖类物质 ， 高碘酸氧化破坏真 菌菌壁的多糖类物质（ 结构的碳键， 将多糖分子的乙二醇 基碳键打开， 生成醛类化合物） ， 暴露出游离的醛基， 醛 基与无色品红结合，生成新的红至紫红色复合物而显色。 （三） 真菌染 色原理 38 高碘酸： 无色结晶，具有强烈刺激和腐蚀性。氧化剂。 偏重亚硫 酸钠：
21、刺激性气味 （ 二氧化硫气味） ， 长时间暴露在空气中易被氧 化 （ 密封保存 ） 。 碱性品红 活性炭 （四） 染色化 学试剂 选择 0.5% 高碘 酸水溶液 ： 无色品红 液/Shiff： （ 2-8C冰箱1-数年） 变成红色废弃（也可在染液内加适量偏重亚硫酸钠） 0.5% 偏重 亚硫酸钠 ： 亮绿：亮绿0.2g+0.2% 冰醋 酸水溶液100ml （五） 染液的 配制及 保存 39 40 无色品红液/Shiff试剂热配法 碱性品红1g ，1mol/L 盐酸（ 蒸馏水91.5ml + 浓盐酸8.5ml ） 20ml，偏重亚硫酸钠1-1.5g，蒸馏水200ml，活性炭2g 无色 品红 碱性品
22、红 1g 蒸馏水 200ml 1mol/L盐酸 20ml 偏重亚硫 酸钠 1-1.5g 冷却至25 + 冰箱/ 暗处12-24h 加热煮沸、溶解， 冷却至50C，过滤 红色 + 慢慢变淡 摇动，溶解 淡土黄色 活性炭2g， 震荡2min后过滤 。 棕色瓶密封 、冰箱保存 + 无色清液 41 无色品红液/Shiff试剂 冷配法 1.Lyons PAS法 0.5g 碱性品红溶于15ml 的1mol/L 盐酸， 加0.5% 偏重亚硫酸 钾85ml ， 放置24h ， 加0.3g 活性 炭 振摇2min ， 过滤，4C 冰 箱密封保存。 2.Shiff试剂 1g 碱性 品红+1.9g 偏重 亚硫酸钠
23、溶 解于100ml 的0.15N 盐 酸中， 不停的摇动 （ 几小时） ， 至溶液呈 淡黄色。加入500mg活性 炭 ， 摇动1-2min ， 过滤 。 呈无色透明。4C 冰箱密封保存 。 42 无色品红质量的检测 方法一：自来水中滴加几滴无色品红染液 质量好：自来水立即变成洋红色 质量不好：自来水缓慢变成粉色/不变色 方法二：取适量甲醛，将无色品红液体滴入几滴 质量好：甲醛立即变成洋红色 质量不好：甲醛立即变成紫蓝色 43 染液配制中的注意事项 1. 配制 无色 品红染 液时 ， 玻璃 容器 必须清 洁干 净， 最好 用重 铬酸钾洗液浸泡清洗。 2.碱性品红试剂质量的好坏决定了染液配制的成败
24、。 3. 偏重亚硫酸钠质量一定要纯 （ 有较 浓刺激 性气味 ） ， 陈 旧（时间过久）无硫的试剂不能再用 （染液配 制失败失 败） 。 4. 无色 品红 使用后 可倒 回瓶内 放入 冰箱保 存，如此反 复使 用 多次， 当染液变为红色时， 一般应废弃（ 每100ml淡红色染 液中加 入0.7-0.9g偏重亚 硫 酸钠 ， 过滤， 红色 消失后也 可继 续使用）。 44 1、切片常规脱蜡至水。 2、0.5%高碘酸氧化5-10min，自来水洗，蒸馏水洗。 3 、 滴加无色品红染液染色15-30min （ 染液回收需暗处染色 ） 。 4、0.5%偏重亚硫酸钠滴洗2次，每次2min，流水洗5min。
25、 （自来水洗冲洗10min，直到褪色成粉红色）。 5、亮绿复染数秒，流水稍洗。 6、常规脱水透明，中性树胶封固。 （六） 染色流 程 45 染色过程中的注意事项 1. 染色前将无色品红染液从冰箱取出恢复至室温 （20min 以 上） 后再进 行染色，染色时间根据室温而定（15-30min） 。 2. 高碘 酸氧 化的温 度过 高/ 时 间过 长可使 一些 物质成 分发 生 非特异性反应，出现假阳性反应。 （20-25C 8-10min） 3.关于偏重亚硫酸钠滴洗，可直接用流水冲洗5-10min。 4. 真菌 复染 可用苏木 精、 亮绿 来 复染 ， 也可 不复 染 。 （基底 膜复染时 的苏
26、木精勿用 高碘 酸氧化配制 的） 46 真菌红色 其他组织绿色 黏液红色 （七） 染色结 果 47 组 织自身 物质 组织黏液 成分 阳性可作 为最佳 对照。 48 1.化学试剂的选择： 碱性品红、偏重亚硫酸钠、活性炭的质量非常重要。 用后密封，定期更换。 2.无色品红的配制与保存： 热配法、冷配法染色效果基本一致，密封、冰箱保存。 配制出优质的染液，可使用数年。 （八）小 结 做好 真菌染 色的要 素 49 四、淀粉样物染色 刚果红法 50 结 构特点： HE染色切片 中呈 淡红色片 状结构 是 一种细胞 外无 定形的嗜 酸性物质 刚 果红染色 偏光镜下 呈“ 苹果绿” 双折光 常 沉积于
27、小血管 和浸润在 细胞间隙 （一） 淀粉样 物形态 结构 51 电镜下： 淀粉样物 在细胞外 呈现出一 种独特的 原纤 维 排列结构 ，随意排 列（交叉/ 平行 ） 。 偏光镜下 呈现绿色 双折光实 际上作为 验证淀粉 样物 的 标准方法 。 （二） 淀粉样 物的双 折光性 52 刚果红是一种分子为长线状的偶氮染料， 其 染料 分子上的氨基和 淀粉样物质上 的羟基进行结合， 平行的 附着在淀粉样蛋白的纤维上而着色 （ 橘红 色）。 （三） 刚果红 染色原 理 53 甲基紫法：染色快， 染色后不 能经 酒精、结果 易褪 色 。 刚果红法：染色快， 染液稳定 。 退行性染色法 （Highman ）
28、 ： 弹力纤维、 胶原纤维、 甲状腺胶质可深浅 不同的着 染。 碱性刚果红染色（ 碱性刚果红法、Stokes 法 ） ：淀粉样物以外物质很 少着色， 无需 分化，染 色时 间较长（20-25min），易 脱片 。 高锰酸钾+刚果红染色法 原发性淀 粉样 变（AL）- （阳性）与 继发 性淀粉样 变（AA ）- （阴性 ） 高锰酸钾 孵育 后，AA蛋白失 去了对刚 果红 的亲和力 。 （四） 淀粉样 物染色 方法的 选择 54 刚果红染 液： （ 出现沉淀更换） 刚果红0.2g+50% 酒精100ml 碱性酒精 分化液： 氢氧化钾0.2g+80% 酒精100ml （五） 染液的 配制及 保存 5
29、5 1、切片常规脱蜡至水。 2、刚果红染液染10min。 3、碱性酒精分化几秒，自来水洗，（镜下控制至适度）。 4、苏木素浅染胞核，盐酸酒精稍分化、蓝化。 5、常规脱水透明，中性树胶封固。 （六） 染色流 程 56 染色过程中的注意事项 1. 碱性酒精分化不易掌握， 最好在显微镜下控制（ 水洗后观 察 ） ， 若 分化过度 （ 淀粉样蛋白被脱色） ， 可将切片水洗后再 加刚果红染液重新染色。 2.刚果红染液滴染时染色易扩散，避免组织干燥。 3. 刚果红染淀粉样物的同时 ， 易 把 胶原纤维、 弹力纤维、 甲状腺胶质等物质染成红色，应根据形态注意区分。 4.最好在偏光镜下进行观察判别。 57 淀
30、粉样物橘红色(偏光镜“苹果绿”双折光) 核蓝色 （七） 染色结 果 58 1.碱性酒精分化控制 分化几秒 后， 水洗，镜 下观 察着色程 度。 2.偏光镜的观察 采用偏光 镜观 察是阳性 结果 确认的最 佳方 式。 （八）小 结 做好 淀粉样 变的要 素 59 五、胶原纤维染色 Masson 染色法 60 三 种纤维中 数量最多 、分布最 广泛 粗 细不等、HE 染色呈 粉红带状 由更细的胶原原纤维粘合而成 ， 电镜下呈规律性 交 替排列， 形成明暗 相间的横 纹。 （一） 胶原纤 维的形 态结构 61 Masson/VG 染色均是利用两/ 三种阴离子染料混合 一 起先后作 用而完成 鉴别染色
31、 。 结构疏松、 渗透性高的组织多选择大分子染料， 结 构致密、 渗透性低 的多选择 小分子染 料。 （二） 胶原纤 维染色 原理 6/3/2016 VG VG染色：肌纤维（苦味酸） 胶原纤维（酸性品红） Masson染色：肌纤维（丽春红酸性品红） 胶原纤维（苯胺蓝/亮绿）。 胶原纤维染色的几种阴离子染料分子量： 苦味酸 （229.11 黄色） 丽春红2R（480.43 红色） 酸性品红 （585.55 红色） 苯胺蓝 （737.74 蓝色） 丽春红S （760.57 红色） 亮绿 （792.82 绿色） 红细胞对阴离子渗透性最小；肌纤维次之；胶原纤维最大。 Masson 63 Weigert
32、铁苏木素： 甲液：苏 木素1g+ 无水酒精100ml 乙液：29%三氯化铁液4ml+ 蒸馏水95ml+ 盐酸1ml 丽春红酸性品红液： 丽春红2R 0.7g+ 酸性品 红0.3g+1% 冰醋酸 水溶液100ml 1%磷钼酸水溶液 2%醋酸苯胺蓝液： 苯胺蓝2g+2% 冰醋酸水 溶液100ml 1%亮绿液： 亮绿1g+1% 冰醋酸水溶 液100ml （三） 染液的 配制及 保存 使 用前等 量混合 一 天内有 效 64 染色过程中的注意事项 1. 丽春 红酸 性品红 染液 可配制 成复 合染液 ：酸 性品红1g+ 丽 春红2g+橙黄G2g+0.25%醋酸300ml。 2. 目前组织几乎用甲醛固定
33、 ， 若组织染液不佳可考虑切片 在脱蜡水化后放入Bouin 固定液固定（37C2h ） ， 水洗至 黄色变为无色再进行染色。 （对结 缔组织及 肌纤 维有媒染 作用 ） 3.Weigert铁苏木素临用前混合，防止氧化沉淀而失效。 65 1、切片进行常规脱蜡至水。 2、Weigert铁苏木素5-10min，自来水洗。 3、1%盐酸酒精分化数秒，流水冲洗10min。 4、丽春红酸性品红液10min，自来水洗，蒸馏水洗。 5、1%磷钼酸水溶液分化1-3min。 6、直接用2%醋酸苯胺蓝液/1%亮绿液复染5min。 7、1%冰醋酸水溶液处理2min。 8 、95% 酒精 、100% 酒精脱水， 二甲苯
34、透明， 中性树胶封固 。 （四） 染色流 程 66 染色过程中的注意事项 1. 铁 苏木 素染 胞核可 改 用天青 石蓝 及Mayer苏 木素代 替（ 铁 苏木素为醇溶性， 滴染时容易在玻片扩散而造成切片干燥 。 2.1% 磷钼酸染色（ 分色 、 媒染 ） 时 ， 应在镜下观察控制时 间 （ 数秒-3min ） ， 至 肌纤维呈红色 ， 胶原纤维呈淡红色/ 无 色为宜。 3.1% 冰醋酸作用在于除去结合过多的亮绿， 时间不能过长。 4. 胶原纤维染色也可选择方法较为简单的Van Gieson染色 法 ， 但VG染色酸性品红易溶于水 、 苦味酸易溶于酒精， 因 此，VG染色后，经水、酒精都要迅速
35、。 67 胶原纤维 、 软骨、 黏液：蓝色（ 苯胺蓝 ） 、 绿色 （ 亮绿） 肌纤维、红细胞、胞质、神经胶质：红色。胞核：黑色 （五） 染色结 果 亮绿复染 苯胺蓝复染 68 磷钼酸分 化时 镜下控制 ，至 肌纤维呈 红色 ，胶原纤 维呈 淡红色/ 无色 为止 69 1.染液的配制： 选择丽春红2R（分子量 小） 2.分化的控制： 数秒-5min左右，时间过长红色 会被脱掉 （六）小 结 做好Masson染 色要素 70 六、中性和酸性粘液物质染色 爱尔新 兰- 高碘酸- 无色品 红法 （AB-PAS 法） 中性黏液物 质 酸性黏液物 质 混合性黏液 物 质 黏液物质 胃黏膜表面上皮、十二指
36、肠腺、颌下腺、前列腺上皮 细胞等 硫酸化黏液物质 非硫酸化黏液物质 强 硫酸化 黏液物质 （结缔 组织黏液 物质） ： 皮 肤、动 脉、肺、 软骨、 角膜、肥 大细胞 弱 硫酸化 黏液物质 （上皮 性黏液物 质）： 小 肠、结 肠、气管 、呼吸 道和消化 道杯状 细胞 眼 球、脐 带、支气 管和消 化道杯状 细胞等 部分组织被显示的中性与酸性之间的一种不同的混合 性物质。 71 （一） 黏液物 质的分 类及分 布 72 1.正常胃黏膜分泌中性黏液，而肠化杯状细胞含酸性黏液 （鉴别杯状细胞） 2.黏液物质染色主要用于黏液性肿瘤的诊断和鉴别诊断， 如黏液瘤、黏液肉瘤、胃低分化腺癌、软骨黏液样纤维瘤
37、。 3.胃黏膜癌变时，细胞黏液为酸性（低分化腺癌，尤其是 印戒细胞癌诊断有一定帮助。） 4.黏液染色阳性与定位 应在相应位置才有价值和意义（如胃印戒细胞癌）。 （二） 黏液物 质染色 的价值 及定位 73 胃：低分化腺癌，部分为印戒细胞癌（AB-PAS） 74 1.中性黏液物质染色（PAS）原理： 高碘酸氧化破坏多糖类物质 （ 结构的碳键， 将多糖分子的 乙二醇基碳键打开 ， 生成醛类化合物 ） ， 暴露出游离的醛 基 ， 醛基与无色品红结合， 生成新的红至紫红色复合物而 显色。 2.酸性黏液物质染色（AB （PH2.5 ） ）原理： 阿 利 新蓝染料分子中带正电荷的盐键 与 酸性黏液物质中带
38、 负电荷的酸 性基团结合 而呈蓝色。 （pH2.5 时 ，含羧基和弱硫 酸 根的黏液 物质 蓝色。强 硫酸 化黏液物 质不 着染。） （三） 黏液物 质染色 原理 75 阿利新蓝液（pH2.6-3.0） 阿利新蓝8GX 1g+蒸馏水97ml+冰醋酸3ml （ 阿 利 新蓝染色力强 ， 色调牢固 ， 染色时间长也不会过染。 染液也可 保存很长 时间 。） 0.5%高碘酸水溶液 0.5%偏重亚硫酸钠水溶液 无色品红液（Schiff试剂） （四） 染液的 配制及 保存 同真菌染 色 76 1、切片常规脱蜡至水。 2、3%醋酸液3min。 3、阿利新蓝液染10-30min，蒸馏水充分洗。 4、0.5%
39、高碘酸氧化5-8min，自来水洗，蒸馏水洗。 5、入无色品红染液15-30min。 6、0.5%偏重亚硫酸钠滴洗2次，每次2min，流水洗5min。 7、苏木精淡染核，盐酸酒精稍分化，自来水洗。 8、常规脱水透明，中性树胶封固。 （五） 染色流 程 77 染色过程中的注意事项 1. 在 阿 利 新蓝染色前加3% 醋酸目的是为了保证其染液pH 的 稳定性能。 2.AB 可根据不同组织与病变特点及特殊需要， 而进行多种 复合染色，如AB+PAS+网状纤维，免疫组化+AB等。 3.AB+PAS亦称套染，必须先经AB染色，再经PAS染色。顺序 可影响最终结果。 4. 苏木精染液淡然很重要， 目的是防止胞浆或黏蛋白着色 而掩盖阿利新蓝的颜色。 78 中性黏液 物质 ：红色 酸性黏液 物质 （硫黏蛋 白和 唾液黏蛋 白） ：蓝色 中性酸性 混合 黏液：紫 色 （六） 染色结 果 酸性黏液物质-蓝色 中性黏液物质-红色 中性和酸性混合物-紫色 79 胃：低分化腺癌，部分为印戒细胞癌（AB-PAS ） 80 1.无色品红的配制与保存 2.规范的染色流程 （七）小 结 做好AB-PAS染 色要素 81 81 含 铁血黄 素染色 如何才 能做出 一 张优质 的切片 ？ 网 状纤维 染色
