1、HIV-1 P24 抗原检测方法研究进展关键词：HIV-1 P24 抗原；酶免疫测定法；检测方法今年是世界艾滋病流行以来的第 33 个年头,全球艾滋病流行与防治形势都发生了巨大的变化。自上世纪九十年代中期高效联合抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）技术应用以来 ,成千上万的艾滋病病人得到有效治疗。然而，由于 HIV 本身的高变异率，导致临床上尚无有效的根除 HIV的治疗方法。因此，对艾滋病的防控手段仍以预防为主。目前，对 HIV 感染的检测方法包括抗体检测、P24 抗原检测、核酸检测以及 CD4+T 淋巴细胞水平检测等。由于从
2、感染 HIV 到出现可检测的抗体尚有一段时间，因此虽然抗-HIV 检测的 ELISA 试剂经历了 4 代发展 1，但其“窗口 期”问题仍不可避免；而可以进一步缩短“窗口期”问题的核酸检测和 CD4+T 淋巴细胞水平检测，由于其检测过程较复杂、耗时较长且需要特殊仪器而不易普及。HIV-1 侵入人体后，核心抗原 P24 的水平随着病毒 RNA 水平的发展而发展，并在急性感染期即可出现，通常被认为是病毒复制的间接标志，与病情发展密切相关。因此，血液及其他体液标本中 P24 抗原的检测可以缩短窗口期，有助于 HIV-1 的早期诊断、预后判断及评价抗病毒治疗的效果，具有良好的实际应用价值。1 P24 抗
3、原的生物学特性HIV 属于逆转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，为直径约 100-120nm的球形颗粒，由核心和包膜两部分组成。核心包括两条单股 RNA 链、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类，包括逆转录酶（RT,P51/P66），整合酶（INT,P32）和蛋白酶（PI，P10）.核心外面为病毒衣壳蛋白（P24，P17）.病毒的最外层为包膜，其中嵌有 gp120(外膜糖蛋白)和 gp41(跨膜糖蛋白)两种糖蛋白。HIV 基因全长约 9.8kbp,含有 3 个结构基因（gag,pol 和 env）、2 个调节基因（tat 反式激活因子、rev 毒粒蛋白表达调节因子）和 4 个辅助基因（nef 负
4、调控因子、vpr 病毒 r 蛋白、vpu 病毒 u 蛋白和 vif 毒粒感染性因子）。HIV 变异性很强，各基因的变异程度各不同。其中以 env 基因的变异率最高，gag 和 pol 基因相对保守。Gag 基因编码 55kd 的前体蛋白，在 pol 基因编码的蛋白酶的加工下产生 P17、P24 和 P55 蛋白，因此 P24 蛋白氨基酸顺序高度保守，这使其在 HIV-1 感染的检测中显示良好的规律性。2 P24 抗原的检测方法2.1 ELISA 检测 P24 抗原 目前，商品化的 P24 抗原检测试剂盒都是依据夹心Elisa。首先以 P24 单克隆抗体包被微孔板，加人待检标本孵育，待检标本中若
5、存在 P24 抗原，则被“捕捉”结合于包被抗体，然后依次加入生物素化的抗HIV 多克隆抗体、链亲合素化的辣根过氧化物酶和反应底物显色，最后用酶联免疫检测仪测定 OD 值判断结果。标准 P24 抗原检测方法的阳性检出率相对较低，在无症状携带者中通常仅为 8一 10，在艾滋病相关综合征(AIDS-relatedcomplex，ARC)患者中为 12，在 AIDS 患者中为 37一 86。这种低检出率可能与感染早期 P24 核心抗原量较少，以及在病情发展阶段 P24 抗原与抗体形成抗原抗体复合物阻碍了抗原的检测有关。改进标准的方法或设计新方法，可以增强检测的敏感性，提高阳性检出率。目前开发的第 4
6、代 H1V 诊断试剂就是在第 3 代试剂的基础上，加入了 HIV-1P24 抗原检测系统，可同时检测血清血浆中的 HIV-1 抗体和 P24 抗原，使诊断窗口期与第 3 代 ELISA 检测试剂相比，平均缩短了 4d，使艾滋病早期诊断的效果明显优于第 3 代。既便如此，第 4 代试剂仍然有 2-3 周的诊断窗口期。此外，由于抗原和抗体同时包被在反应板上，存在着相互干扰的可能，影响了免疫反应的特异性，再加之第 2 窗口期的存在，影响了检测的敏感性。因此通常来讲，使用第 4 代试剂检测 P24 抗原，其灵敏度(20-l00)pg/m1远远低于单独检测抗原抗体分析法(3.5-10)pg/m1。从方法
7、学上来讲，这种基于 ELISA 的分析方法，灵敏度终归是有限的，相对化学发光和时间分辨荧光免疫分析技术等更为先进的分析方法，其灵敏度仍较低 2-5。2.2 P24 抗原检测的新方法 由于 ELISA 本身的局限性以及 P24 抗原检测在HIV-1 诊断中的重要作用，近几年来国内外对建立高灵敏度检测 P24 抗原的研究一直就未曾停止过。先后研发了免疫复合物解离 P24 抗原测定法(immune-complex disassociate，ICD)，信号放大增强 ELISA(signal-amplification-boosted ELISA)，超敏感酶免测定法(ultrasensitive enz
8、yme immunoassay，UEI)，免疫吸附电镜法(immunosorbent e1ectron microscopical method，ISEM)和纳米粒子生物条形码检测技术(nanoparticle-based biobarcode amplification assay，BCA)等新方法。2.2.1 ICD 与信号放大增强 ELISA 近年来发展起来的 ICD 分析方法，是指用酸、碱或加热的方法使免疫复合物发生解离。常用的方法是用热处理将血清中免疫复合物解离后，再进行测定，从而提高检测血清中 P24 抗原的敏感性和阳性检出率。SchUpbach 6等分别用热处理和酸化的方法解离免
9、疫复合物后用 ELISA 检测，发现其阳性率由 26.5分别提高到 67.8和 53.1。信号放大增强 ELISA是利用生物素标记的 Tyramide 扩增信号，然后使用偶合有荧光素的亲和素进行检测，它是基于 TSA 信号放大系统的 ELISA 检测方法，其灵敏度远远高于普通ELISA。2003 年，Sutthent 等 7将免疫复合物热解离后通过 TSA 信号放大系统的 ELISA 使 P24 抗原检测的最小检出值由原来的 10ps/ml 降至 05pg/l，在HIV-1 抗体阳性母亲所生婴儿早期的诊断中与 RNA 检测相当，与 HIV 核酸检测具有可比性，具有重要的实用价值。2006 年，
10、Nouhin 等 8对 167 份血液样本进行分析后发现，普通 ELISA 和增强 ELISA 的最小检出值分别为 10pg/ml 和2pg/ml，将核酸检测、增强 ELISAP 24 抗原检测和病毒培养等方法进行分析后发现其特异性均为 100；其敏感性则依次为：100(pol-DNA-PCR)，935(gag-DNA-PCR)，91.3(增强 ELISAP24 检测)和 91.1(病毒培养)。这些研究结果表明 ICD 及信号放大增强 ELISA 检测 P24 抗原的方法，与核酸检测和病毒培养具有相近的灵敏度和特异性，但由于其操作更简单、耗时更少、成本更低而具有更为广阔的应用前景。2.2.2
11、UEI UEI 又称双位点免疫复合物转移酶免疫测定法，其基本原理是利用高亲和力抗体浓缩富集 P24 抗原，然后进行检测。其技术路线是：将待检样本中的抗原同时与 2，4-二硝基苯酚-生物素-牛血清白蛋白-抗重组 P24 抗体Fab， 复合物及另 1 种抗重组 P24 抗体 Fab， -D-半乳糖苷酶复合物反应，形成抗原与这两种复合物的复合物，用包被有抗-2，4-二硝基苯酚的有色聚苯乙烯珠吸附这种复合物，洗涤去除多余的 -D-半乳糖苷酶；然后用过量的 2，4-二硝基苯酚赖氨酸复合物竞争性地使抗原复合物解离下来，转移结合到链亲和素包被的白色聚苯乙烯珠上，通过洗涤更加完全地除去非特异性结合的 -D-半
12、乳糖苷酶，最后加入底物，并以荧光检测仪分析白色聚苯乙烯珠上的 -D-半乳糖苷酶活性 9。Hashida 等 10通过优化反应条件大大缩短了检测时间，将整个免疫反应时问(包括复合物的形成、吸附及转移)缩短为 l530min，并可检测出 P24 抗原浓度仅为 024pg/ml 的血清样本中的抗原，样本用量仅需l0L；并且与 HIV 抗体的 ELISA 检测相比，可提前 1220d 检测到 P24 抗原。该法灵敏度高、特异性强、操作简单、成本低廉，有望在发展中国家成为替代HIV RNA 检测的 1 种重要方法。2.2.3 ISEM ISEM 是将抗原抗体的特异性与电子显微镜的高分辨率相结合，对病毒颗
13、粒直接特异性检测的 1 种方法。该方法与胶体金免疫标记结合起来的技术，可用于检测 HIV-1 的可溶性 P24 抗原，并可检测多种体液样本(如血液、精液、唾液及脑脊液)中的 P24 抗原。但该法仍处于早期研究阶段，其对血液中P24 抗原检测的敏感性比 EIA 法稍低，但其它体液中的敏感性则比 EIA 法更高。但因其需要昂贵的仪器，且操作复杂，距临床实际应用尚有一段距离。2.2.4 BCA 基于纳米技术的生物条形码检测技术是根据免疫学原理，应用特异性抗-P24 单克隆抗体，特异性结合样本中的 P24 蛋白抗原，通过生物条形码DNA 准确而特异地放大，间接定量检测 HIV-1 P24 抗原 11。
14、其技术路线为：第一步，先用抗-P24 抗原的单抗功能化的磁性微珠 MMPS(magneticmicroparticle)特异性结合样本中可能存在的 P24 抗原，加上磁场固定 MMPS，用 PBS 溶液反复冲洗，除去未连结的抗原和不相关的蛋白；第二步，加人被双链 DNA 和抗-P24 的多抗修饰的金纳米微球 NP(Au nanoparticle)探针，将 P24 抗原夹在中间，形成一个三明治结构，接着加上磁场，在用磁铁固定化 MMPS 的同时，反复冲洗，除去未连接的 NP 探针；第 3 步，是 1 个去杂交步骤，三明治结构被磁场固定，则 NP 探针上结合的数以百计的条形码 DNA 被释放在溶液
15、中，接着对条形码 DNA进行定量，从而对微量目标蛋白信号进行了放大。这一过程类似于聚合酶链式反应(PCR)中 DNA 聚合酶的使用。生物条形码检测的关键是通过形成三明治结构将特异抗原均一得分离。灵敏度提高的关键在于目标抗原的有效回收和作为每个抗原识别结合位点对应的条形码 DNA 链释放的结果的放大过程。条形码 DNA的量对应了微量目标蛋白的量，因此我们可以通过定量条形码 DNA 间接定量微量蛋白。通过这种方法和适当的抗体，可以程式化地在像血浆这样的复杂样本中检测到低至 30 个拷贝的目标蛋白。Kim 等 12应用 BCA 检测 112 份 HIV-1 感染血浆样本中的 P24 抗原，发现 BC
16、A 可检测各个亚型 HIV-1 的 P24 抗原，特异性100，敏感性 99，远远高于普通 ELISA 法检测 P24 抗原的敏感性(34/112)。Tang 等 11应用改进的 BCA 进行研究发现(用抗-P24 包被微孔板捕获样本中的P24 抗原，用链亲和素包被的纳米粒子生物条形码 DNA 扩增信号，然后用芯片扫描进行检测)，这种方法较普通 ELISA 敏感 150 倍，45 例 HIV-1RNA 阳性血浆的 BCA 检出率为 100，且可比普通 ELISA 法提前 3d 检出 P24 抗原。BCA 法不失为一种早期检出 P24 的较为敏感的方法。3 P24 抗原检测的临床应用及发展前景目
17、前许多国家均采用测定病毒 RNA 的方法来缩短检测窗口期，病毒 RNA 的检测窗口期短，且在 HIV 感染的各阶段均存在，因此这种方法也常被应用于监测病程进展和判断抗病毒治疗效果。RNA 测定法较 P24 检测法成熟、灵敏度高，但因其操作复杂、耗时长、花费高，且需要特殊昂贵的仪器，因此，在许多发展中国家中难以推广应用，有碍疾病的治疗和控制。2004 年，HIV 病毒发现者之一、美国马里兰大学 DrGallo 13领导的实验室的 1 篇高灵敏度检测 P24 抗原的研究论文引起了广泛的关注：P24 抗原检测方法的灵敏度得到了大幅提高。随着其检测灵敏度的不断提高，P24 抗原的检测逐渐从主要用于在窗
18、口期辅助早期诊断和进一步缩短窗口期，发展到用于病毒载量的测定。目前，P24 抗原在以下几方面都有重要应用：抗-HIV-1 不确定或“窗 12 期”的辅助诊断；抗-HIV-1 阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断；第 4 代 HIV-1 抗原/抗体 ELISA 试剂检测呈阳性反应，但抗-HIV-1 确认阴性者的辅助诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。随着 P24 抗原检测技术的不断进步，低成本的 P24 抗原检测有望在一定程度上替代现有的昂贵的 RNA 测定法。参考文献1 Ly T. D., Laperche S., Brennan C., et al. Evaluation of the sen
19、sitivity and specificity of six HIV combined p24 antigen and antibody assays J. Journal of virological methods, 2004, 122(2): 185-94.2 魏民, 邵一鸣 . HIV 实验室检测研究进展和发展趋势 J. 国外医学: 病毒学分册, 2003, 10(3): 65-9.3 沈霞. 艾滋病的实验室诊断 J. 中华检验医学杂志, 2003, 26(5): 327-8.4 张麒, 佐拉 , 秦光明, et al. 评估第 4 代 HIV 酶联免疫法诊断试剂对静脉吸毒者感染窗口
20、期的检测能力 J. 中华检验医学杂志 , 2006, 29(7): 631-4.5 李素敏, 王润田 , 赵云珠. 输血相关 HIV 感染的免疫学检测进展 J. 中国输血杂志, 2004, 17(3): 204-6.6 Schpbach J., Flepp M., Ponteli D., et al. Heat-mediated immune complex dissociation and enzyme-linked immunosorbent assay signal amplification render p24 antigen detection in plasma as sensi
21、tive as HIV-1 RNA detection by polymerase chain reaction J. AIDS (London, England), 1996, 10(10): 1085-90.7 Odoherty U., Swiggard W. J., Jeyakumar D., et al. A sensitive, quantitative assay for human immunodeficiency virus type 1 integration J. Journal of virology, 2002, 76(21): 10942-50.8 Nouhin J.
22、, Nguyen M. Evaluation of a boosted-p24 antigen assay for the early diagnosis of pediatric HIV-1 infection in Cambodia J. The American journal of tropical medicine and hygiene, 2006, 75(6): 1103-5.9 Hashida S., Hashinaka K., Ishikawa S., et al. More reliable diagnosis of infection with human immunod
23、eficiency virus type 1 (HIV1) by detection of antibody IgGs to pol and gag proteins of HIV1 and p24 antigen of HIV1 in urine, saliva, and/or serum with highly sensitive and specific enzyme immunoassay (immune complex transfer enzyme immunoassay): A review J. Journal of clinical laboratory analysis,
24、1997, 11(5): 267-86.10 Hashida S., Ishikawa S., Hashinaka K., et al. Optimal conditions of immune complex transfer enzyme immunoassay for p24 antigen of HIV1 J. Journal of clinical laboratory analysis, 1998, 12(2): 115-20.11 Tang S., Zhao J., Storhoff J. J., et al. Nanoparticle-based biobarcode ampl
25、ification assay (BCA) for sensitive and early detection of human immunodeficiency type 1 capsid (p24) antigen J. JAIDS Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 2007, 46(2): 231-7.12 Kim E.-Y., Stanton J., Korber B. T., et al. Detection of HIV-1 p24 Gag in plasma by a nanoparticle-based bio-barcode-amplification method J. 2008, 13 Gallo R. C., Salahuddin S. Z., Popovic M., et al. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS J. Science (New York, NY), 1984, 224(4648): 500-3.
