1、PCR 定点突变应用实例1、 PCR 定点突变法构建人抗菌肽 FALL-39 基因突变体，并比较研究 FALL-39 及其突变肽的功能：方法：应用 RT-PCR 从人肺腺上皮细胞株 SPC-A-1 总 RNA 中扩增 FALL-39 成熟肽cDNA，以 pGEX-1T 为载体，构建抗菌肽 FALL-39 基因大肠杆菌表达载体；采用一步法和两步法 PCR 体外定点突变技术，用赖氨酸替代第 24 位的谷氨酰胺和或第 32 位的天门冬氨酸，构建 FALL-39 突变体大肠杆菌表达载体；该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化，获得高度纯化的重组 FALL-39 以及突
2、变肽；对纯化产物进行的：MEC、MIC、MBC 和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性，用 RT-PCR 测定人单核巨噬细胞株 THP-1：iNOS 的表达，研究 FALL-39 及其突变肽的抗内毒作用。结果：重组质粒 pGEX-1T-FALL-39 测序结果说明其插入片段序列与 GenBank 登录的 FALL-39 基因的 cDNA 序列相符，且插入方向正确；DNA 测序结果表明在预期位点发生突变，用一步法得到突变体质粒 pGEX-T-FALL-39-Lys32，用两步法得到 pGEX-1T-FALL-39-Lvs24 以及 pGEX-T-FALL-39-Lys2432；重组原核
3、表达质粒 pGEX-T-FALL-39 及其突变体融合蛋白有高效表达，经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白 FALL-39，FALL-39-Lys24，FALL-39-Lys32 和 FALL-39-Lys2432(约 4Kd)：突变后的 FALL-39 蛋白对大肠杆菌 ATCC25922 和耐氨苄青霉素 ML-35p 的抗菌活性明显增强，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)值 FALL-39-Lys2432 最小，其次是 FALL-39-Lys32 和 FALL-39-Lys24，均小于 FALL-39-FALL-39Lys32 和 FALL-39 两种蛋白均在含：Medium E 的
4、 LB 培养基中表现出较高活性，在 LB 培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中 FALL-39-Lys32 蛋白抗菌活性要高于 FALL-39 蛋白。突变后 FALL-39 蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加，较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。突变后 FALL-39-Lys32 蛋白对 LPS 引起的iNOS mRNA 的表达量增强抑制作用明显。结论：用 FALL-39 基因大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白；用高保真的 Polybest DNA 多聚酶进行一步法 PCR 定点突变技术简单、有效；突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内毒素明显增强，对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时
5、未见明显增加，较大剂量时略有增加，提示在 FALL-39 分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。引自：用 PCR 定点突变方法研究人抗菌肽 FALL-39 功能与结构的关系，作者：杨云霞。) f) c2 , E1 8 |2、 基因改造中快速 PCR 定点突变方法应用：铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因为可以消除 O-? 2 而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症，但是由于多种因素影响，尤其是Cu，Zn-SOD 具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有 610min)，使得 Cu，Zn-SOD 的应用受到很大限制。定点突变技术是改造、优化基因常用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关
6、系的有效方法，在医学上还可用于基因治疗等。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸 PCR 定点突变及盒式突变等。但由于这些方法操作繁琐，意外突变多等缺陷，使定点突变的实验受到一定限制。本研究采用一种近年来新的定点突变技术快速 PCR 定点突变方法成功地对 hCu，Zn-SOD 进行了基因改良(将 hCu，Zn-SOD 基因中非活性中心的 Cys111 密码子突变为 Ala 密码子，以提高其稳定性)，同时对该定点突变技术要点进行探讨。1) 材料菌株与质粒? E.coli DH5，由本实验室保存。质粒 pESOD(含 hCu，Zn-SOD 基因、Ampr 基因以及 EcoRI
7、 酶切位点，整个质粒约 33kb) 由本实验室构建，并转化于 E.coli DH5 保存。主要试剂? Pfu 高保真 DNA 聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI 酶(河南华美生物工程有限公司);小量质粒快速抽提纯化试剂盒(上海博亚生物技术有限公司);DNA Marker,T4DNA 连接酶，Eco RI 等常规酶(上海 Sangon 公司)。# % r6 d+ B) N1 k“ # $ WpESOD 质粒提取及鉴定? 用质粒快速抽提纯化试剂盒从含 pESOD 质粒的 E.coli DH5 转化菌里提取 pESOD 质粒，取部分质粒用 EcoRI 酶切后琼脂糖电泳鉴定，另取部分质粒送上
8、海博亚生物技术有限公司测序。$ H; “ x“ j0 l H: x0 L2) 定点突变引物设计? 根据 hCu，Zn-SOD 基因序列和定点突变的要求(将 hCu，Zn-SOD 中第111 位 Cys 的密码子 TGC 突变为 Ala 密码子 GCC)设计出一对包含突变位点的引物(正、反向)P1 和 P2,具体序列如下：P1：5CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCGCAC 3；P2：5GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG 3。下划线的碱基为突变位置。所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。PCR 定点突变? 整个反应体系为 50l，其中含无菌去
9、离子水 41l，10Pfu Polymerase Buffer(含 Mg2+)5l，20molL P1、P2 引物各 1l，pESOD 质粒 1l(约100ng)，Pfu DNA 聚合酶 1l(5U)；反应条件为：94预变性 3min；然后 94变性1min，65 30s，72延伸 7min，25 个循环；最后 72延伸 7min，4保存。转化? 用 Dpn I 限制性内切酶处理 PCR 反应产物，直接转化感受态的 E.coli DH5，涂布培养后随机挑 3 个菌落并提取相应质粒，由上海博亚生物技术育限公司测序，测序引物 P3：5ACTCAGGTACTGGGAGTG 3。 b% ! L“ p3
10、 I) X通过快速 PCR 定点突变，本研究实现了把 hCu,Zn-SOD 基因中的 Cys111 突变为Ala111。整个突变过程只需要 1 次 PCR 反应、1 次 DpnI 酶解和 1 次转化，即完成了定点突变，无需对 PCR 产物进行末端处理，也无需进行亚克隆等，大大减少了传统定点突变的工作量，而突变成功率较高(本次实验随机挑取的 3 个菌落中有 2 个是阳性突变菌落)，尤其适用于大肠埃希菌来源的 DNA。快速 PCR 定点突变的技术要点：(1)准备突变的质粒必须是甲基化。(2)引物是一对包含突变位点的互补的(正、反向)核苷酸链，而且要比一般的 PCR 引物(18bp21bp)长，一般
11、要在 25bp 以上，因为引物中含有突变位点，和模板不能完全匹配。(3)须要高保真的DNA 聚合酶如 Pfu Turbo 聚合酶。(4)PCR 产物要用 DpnI 酶充分酶切消化，以提高突变检出率。(5)PCR 延伸步骤时间要充足；因为 Pfu DNA 聚合酶扩增速率为 05kb min，比 Taq酶慢 1 倍左右。(6)高保真 Pfu DNA 聚合酶酶量要比普通 PCR 所需的 Taq 酶多一些；因 Pfu DNA 聚合酶不但扩增速率较慢，而且一步法 PCR 定点突变扩增的是整个质粒，故所需的总时间比一般的 PCR 时间要长很多，适当增加酶量以补充长时间高温下的酶活力损失。(7)克隆子最后需
12、经测序验证；高保真不等于 100保真。本研究挑选测序的 3 个菌落中有 1 个是未突变的阴性菌落，故后续的测序步骤不能省略。引自：周赞虎，张永祥，陈枝华，刘仁海，田蕴，郑天凌 2007-4-18 9:32:56 中国公共卫生 2007 年 1 月 第 22 卷 第 1 期基于 PCR 技术的常用基因突变检测方法有：1、 PCR/ASO(allele specific oligonucleotide,ASO,等位基因特异性寡核苷酸) PCR/ASO探针诊断点突变，系在扩增 DNA 片段后，直接与相应的寡核苷酸探针杂交，来明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。2、 PCR-SSCP(sin
13、gle strand conformation polymorphism, SSCP) PCR-SSCP 系 1989 年由 Orita 首先报道的，它是一种基于单链 DNA 构象差别来检测点突变的方法。该方法操作简单、灵敏且特异性高，是目前检测点突变最简捷的方法。3、 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism，RFLP，限制性片段长度多态性分析)RFLP 分析与 PCR 反应相结合，先用 PCR 来扩增待检的片段，再进行 RFLP 来检测那些发生在酶切位点的突变简化了 RFLP 的分析过程，并使该项技术得到了广泛的应用。4、 DNA
14、 序列测定法(direct sequencing, DS)PCR 产物经克隆后测序或直接对 PCR 产物进行测序是所有进行基因突变检测的方法中最灵敏、最直接、最全面的，不仅可以确定突变的部位，还可以确定突变的性质。尤以循环测序法最具有代表性，该方法以 TaqDNA 聚合酶代替测序酶。测序反应通过多次的变性、退火、延伸来完成，具有快速、简便、灵敏等优点。但是 DNA 序列测定法所需的仪器和高昂的费用限制了它在临床诊断中的应用。! 1 z7 w1 i- % A3 t5、 异源双链分析(heteroduplex analysis, HA)该方法类似于 SSCP。在一个 PCR 反应中，如果同时存在野
15、生型和突变型的 DNA 模板，那么在 PCR 循环中突变型和野生型 DNA 形成的杂合双链 DNA 分子即异源双链 DNA 片段，它与同源双链在聚丙烯酰胺电泳中呈现不同的电泳速率，经聚丙烯酰胺电泳就可以将仅有一个碱基改变的异源双链片段与同源双链片段分开，从而达到诊断碱基突变的目的。该方法依赖于双链 DNA 分子序列依赖性的构象变化。对于小于 300bp 的小 DNA 片段其敏感性较好，且已在许多遗传性疾病中得到应用。6、 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)DGGE 是一项根据 DNA 解链特性分离鉴定 DNA 片段的技术
16、。在温度和变性剂浓度增加时，DNA 分子内一些称为变性区域的独立片段将发生变性。PCR 扩增片段通过一线性增加的变性凝胶电泳体系时，一旦进入相当于某些区域解链温度(Tm)的变性剂浓度区将会解链形成分叉的 DNA 分子，并因此使迁移率显著下降。变性区域的解链温度(Tm)由其核苷组成决定，序列中发生一个碱基的改变，其解链温度 Tm 改变 1.5，在变性梯度凝胶上表现出不同的迁移率。同 SSCP比较，DGGE 需要制备新鲜的梯度胶，检出率也较低，且只能确定突变的存在，不能进行突变位置和性质的定量分析。但 DGGE 无需知道待测片段的 DNA 序列，无需制备测试引物。# |9 D+ u/ t2 _ q
17、0 w7、 化学错配裂解法(chemical mismatch cleavage, CMC) CMC 是将同位素标记过的野生型 DNA 分子和突变型 DNA(或 RNA)片段混合后经过变性与复性, 形成 DNA-DNA 或 DNA-RNA 的异源杂交双链，在突变部位会产生凸起。对凸起处错配碱基进行化学修饰并使之从双链分子上断开，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影即可确定是否有突变发生。CMC 法最大优点是能对放大片段进行“扫描”式分析,存在于序列中任何部位的突变都能被检出,多用于多基因突变的遗传病。9 T3 5 Q% h! C; r r0 O3 k此外还有等位特异性 PCR(allele specific PCR,AS-PCR)、PCR 核糖体分型(ribotyping)技术、可变数目*重复(variable number tandem repeats,VNTR)序列和短*重复(short tandem repeats,STR)序列分析等方法可用于基因突变的分析。这些方法各有所长，具有不同的优缺点，在不同的领域内有着不同的应用。无论是哪种检测技术都体现了 PCR 技术本身所具有的优越性,在实际应用时，可根据实验目的和具体需要，选择最恰当的方法或将不同的方法联合应用，PCR 的应用将使基因突变检测技术有更广阔的应用前景。
