1、细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1.细胞爬片，5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。2. PBS 清洗标本 3 次 各 1 min。3 .冰丙酮固定 15 min(或 4%多聚甲醛固定 30min)。4. 空气干燥 5min。5. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min。6. 0.5%Triton X-100( DPBS 配 ) 孵育 1 次 20min。7. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min。8 .3%H2O2（试剂 A）孵育 15 min。9. DPBS 清洗标本 3 次 各 2 min。10. 封闭血清孵育（试剂 B） 20min。11 .一抗孵育（滴度 1：200，湿盒）4 过夜
2、或 3760 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用 PBS 液12. PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂 C） 3730 min。14 .PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。15. 试剂 D（湿盒） 37 30 min。16、PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。17、DAB 显色（避光，镜下观察至棕色 ） 约 310min。18、蒸馏水洗 2 次 1 min。19、苏木素复染 0.51min。20、自来水洗返蓝。21.梯度酒精脱水 75，85，95，100%各 3min。22.二甲苯透明 2 次 3min。23、中性树胶封片。注意事项：
3、1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：a 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达 5 天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；b 接种的细胞密度适中以 2*104/ml 为宜，若密度太高 5 天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于 4C 冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用 80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿， （不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、Triton X-100 表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时
4、间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？ 1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在 24 孔，或 6 孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。 2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油） 。细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面
5、张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概 6、7 个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下，到固定时细胞生长到 80左右比较合适。 偶是在盖玻片上做的， 首先细胞要爬的匀一些，象dongwp 战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。细胞爬片的保存和抗原修复问题总结 1. 细胞爬片可以用 含 叠氮钠 PBS 液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢! 加在液体中作为防腐剂的叠氮
6、钠浓度一般为 0.04-0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题!2. louischen wrote:但我的细胞爬片经过 4%多聚甲醛固定，PBS 冲洗后直接就放在了-20 度，还能用于免疫组化吗?! 应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的丢失3. mRNA 原位杂交经 4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC 水。其它建议用甲醇固定。-20 度保存4. 如果是 4%多聚甲醛固定，然后放在 PBS 中保存，在 4 度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。5. 丙酮中固定 5-10 分钟，然后风干，放置 4 度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白
7、质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用 0.5%的 triton-100 孵育30 分钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会6. 丙酮固定后，PBS 洗涤 3 次，即可保存至 4 度冰箱备用。7. (1)细胞爬片先用 TBS 洗 3 次，每次 5 分钟 (2)4%多聚甲醛固定，室温， 20 分钟 (3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80 度保存。2 周没有问题的，我保存过 2 个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好8. 我的心肌细胞爬片
8、用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好9. 细胞爬片用 4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用 PBS冲洗后，晾干，放在-20 度保存一个月没有问题的。10. 细胞爬片，有机溶剂如 4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置 2min 左右，弃去固定液，不用 PBS 洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用 PBS 冲洗，在做以后的步鄹11. 我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的
9、问题。细胞培养好后用 PBS 洗一遍，然后 4%多聚甲醛 4度固定 15 分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感，有的差一些。最好避光保存在 4 度，同时尽量隔绝空气。免疫荧光与普通 DAB 显色差别只再二抗的标记，样品的保存应该是没有多大差别的。12. 细胞爬片丙酮固定后-20 度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出 37 度复温然后常规操作就可以了13. 爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能是：1)试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2)加一抗前处理同石蜡切片，可进行
10、抗原修复，如胰酶消化或热修复。3)因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片充分水化很重要。建议试验前用 PBS 浸泡过夜。如不能解决你的问题请 QQ 联系：81825645。本人在湖南省肿瘤医院病理科(长沙市)做免疫组化。14. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放-20 度，2-3 个月是没有问题的。15. 对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片用冰的纯丙酮固定 20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂
11、。 如：1.多聚甲醛(常用 4%)：可用于免疫电镜; 也可用于免疫荧光染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等 2.乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度 3.甲醛(福尔马林)应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液 pH 降低，影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染
12、色结果。16. 4 度是不能保存这么长时间(1 个月)的，如果抗原已被分解，再修复也没用!17. 弃去固定液，不用 PBS 洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70长期保存。18. 爬片置于 37 度 PBS 中洗三次，每次 3 到 5 秒钟，然后在 4%多聚甲醛中固定 15 分钟，然后再用 37 度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。 将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在-20 保存备用，具
13、体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。19. 固定后放点 PBS，然后放在 4 度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题的。20. 固定后 4 度可以存放一周，-20 度存放半年，我现在也要做这个，实验室老师教的。21. 四度放 1 周应该没问题的，你最好放在-20 度，我在-20 度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多，不可能一次作完，一个月没问题.22. 最佳的固定及保存方法： (1)中性缓冲福尔马林( 不必调 pH)： 福尔马林(40%甲醛，用时加入过量碱式 MgCO3 中和) 10.0ml Na2HPO4.12H2o 1.9653g NaH2PO4.
14、2H2O 0.5460g 加 0.85 %NaCl 溶液溶解，定容至 100ml。 (2)细胞固定：待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖玻片，迅速于 37PBS 中漂洗 2 次，每次 3-5 秒，以清除血清。 (3)将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。 (4)用镊子取出盖玻片，PBS 漂洗 2 次，每次 3-5 秒，晾干保存于-20备用。可长期保存，做实验时，取出片子，入 PBS 湿润后即可进行你的实验。 可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。(本帖没有加分)23. 细胞爬片固定以后要放在-20 度的冰箱.1 个月内可以用.24. skywalkerzz wrote:过
15、氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为 30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸泡 10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片? 爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片25. 本人比较喜欢用 4%得多聚甲醛，20 分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干，不要挤压，防止粘片和碎裂。26. 细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS 漂洗后干片保存在 4 度，最长半年没问题。27. 1、用新鲜配制的预冷的 4%多聚甲醛缓冲液室温固定 15 min，PBS (0.01 mol/l, pH7.4) 洗涤 3 遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了 2、爬片
16、 PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗涤 3 遍后是否能保存，怎样保存? 1、洗过就可以做免疫组化了。 2、固定过后自然干燥，不要洗，-20 度保存。做之前再洗。28. 细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用 4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可室温保存在丙酮中，不使之干燥。29. 如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,30. 适当密度后取出固定(丙酮-20 固定 1020min)，再进行免疫染色。31. 一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定 15-20 分钟，然后放-20 度，没有问题。 如果细胞爬片是在 24 孔板或 6 孔板里进行，冷丙酮会
17、腐蚀板子，最好 4%多聚甲醛。32. 细胞爬片用纯丙酮固定 10 分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70 度保存。33. 4%多聚甲醛固定后 PBS 水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20 度冻存不超过 1 月。34. 如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，凉干后再养细胞。35. 可以买 NUNC 公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名 Thermanox Coverslips。高分子材料，耐高温灭菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁剪，使用效果好。 上海生工有现货，不用国外定货。我使用后，觉得效果比玻璃盖玻片效果好很多。36. 我们通常是把细胞玻片固定好后，用 PBS 冲洗干净，然
18、后用酒精脱水(80%，90% ，100% ，100%酒精各一次，每次 10 分钟左右)，然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切片了，可以保存一定的时间。 这个方法我们试过的，保持一段时间后做，效果还是可以的。 免疫细胞化学染色操作规程一、材料和1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用 2%多聚赖氨酸包被处理玻片。2、5-10%正常山羊血清封闭液，用 PBS 配。3、3%牛血清白蛋白（BSA） ，用 PBS 配。4、0.01M PH7.4 PBS5、1% BSA-PBS（含 0.05% Tween20）6、AEC 底物（1）底物缓冲液（20X） PH 4.6醋酸（分子量 60.6） 30.6mlTr
19、iton -100醋酸钠 3H2O（分子量 136.1）66.68 克加蒸馏水到 960ml，调 PH 到 4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml（2）AEC（20X）AEC 15mg/ml，溶在 DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量 73.10 中）（3）0.6% H2O2 （20X）临用时， （1） （2） （3）各 50ul，在 1ml 双蒸馏水中混匀 30分钟内有效。7、DAB（即 DAB-4HCL）（1）1.5 克 DAB 在 100ml 水溶液中（20X）（2）1M Tris（20X） ，用 HCL 调 PH 到 7.4（1） （2） （3）各滴加入 1ml
20、二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。溶解后（可加热到 500C） ，加水合氯醛 50 克（水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量 165.4） ，枸橼酸 1 克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或 40C 保存。8、苏木素复染液苏木素 1 克碘酸钠 0.2 克钾矾 50 克水 1000ml9、含 10%及 2%小牛血清的 DMEM 培养液。10、3%H2O2：30% H2O2 1 份，加 9 份双蒸水，临用时配。11、细胞抗原玻片及 96 孔细胞抗原板（见 ICC protocol 04）12、封片液：1 克明胶，溶于 30ml 350C 水中，加入 35ml 甘油（或用甘油封片）和
21、650mg 石碳酸（先溶于 0.6ml 水中） 。二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用 HRP 标记二抗或SP 法时必须阻断）1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或 370C 10-15 分钟，使恢复温度。2、加 3%H2O2，细胞片 20ul/孔，培养板 100ul/孔，使充分覆盖住细胞。3、室温 10 分钟后，甩掉 H2O2，用 PBS 轻轻淋洗 2 分钟。用滤纸吸干细胞周围水份，96 孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。三、封闭细胞片用 5-10%正常山羊血清（20ml/孔） ，细胞板用 2-5%BSA（PBS 配制）100ul/ 孔，置 370C 孵育 30 分钟后甩掉封闭液，不洗。四、
22、免疫化学染色1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法 10-20ul/孔，细胞板 50ul/孔，使充分覆盖细胞。 371 小时或 4冰箱过夜；2、弃去一抗，如为细胞涂片用 PBST 轻轻简单淋洗 1 次后，浸于 100mL 含 PBST 洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）3-5分钟，转入第二杯 PBS（1000ml ） ，如上法漂洗 3-5 分钟。擦干细胞片周围水分，96 孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST 在摇床上摇洗 3-5 分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复 3-4 次；3、加 S.P（S.P 法，即放大法）（1）加已优选好的浓度的 Biotin 标记二抗，细胞片 10ul/孔，细胞
23、板 50ul/孔，使充分复盖细胞。 37温和孵育 30 分钟；（2）按免疫化学染色2所述方法洗涤和擦干；（3）加已优选好浓度的 S.P，用量同（1），37孵育 30 分钟后按免疫化学染色2法洗涤及擦干；4、间接法加二抗（不放大法）方法同 S.P 法，但不用 Biotin 标记二抗，而改用 HRP 直接标记二抗。并省略（3）步骤；5、加底物显色（1） 、加足量的 AEC 显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/孔，板 50ul/孔，置于 37恒温箱孵育 5-10 分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果（阳性对照显色程度为+ ） ，用自来水即可终止反应；（2）
24、、复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液 1-2 滴，1 分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于 PBS 中约 30 秒钟返蓝色，最后在蒸馏水中漂洗。6、封片洗后细胞片擦去周围水分，滴加 1 滴甘油明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。五、结果判断KSHV 阳性诱导后 BCBL-1 细胞有 10%-30%显红色，强度不一，未诱导 BCBL-1 阳性细胞（1-30%）阴性诱导和未诱导 BCBL-1 细胞完全不显色（排除边缘效应）MCMV/HVMV 阳性感染病毒的细胞有病灶反应，显红色，强度不一，未感染细胞不显红色（排除非特异性染色）阴性感染细胞和未
25、感染细胞不显红色注意：1、一抗、二抗的稀释采用 1%BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀释采用 PBS2、整个反应过程在湿盒中进行（细胞片）3、洗涤时应使用染色缸（细胞片）六、说明1、测血时一抗血清稀释度要求项目 KSHV MVMV HCMV 其它稀释度 1:50，1:100,1:200 1:50，1:100,1:200 1:100，1:500,1:1000 1:100，1:500,1:1000可融合标准 1:100 阳性时 1：100 阳性 1：500 阳性 1：500 阳性 2、S.P 法使用二抗的不同情况项目 MCMV HCMV 其它样品 母、亚上清 血清、母、亚上清 血
26、清、母克隆、亚克隆细胞培养上清一抗为 IgG 型，Biotin 标记二抗 Biotin-Anti mouse IgG F(ab)2,SIGMA,CAT:B6774一抗为 IgM 型，Biotin 标记二抗 Biotin-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT:62-6440稀释度 1：2003、间接法（不放大法）使用二抗的不同情况项目 MCMV KSHV样品 血清 血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清一抗为 IgG 型，HRP 标记二抗 HRP-Anti mouse IgG Fc,1:100,SIGMA,CAT:A-0168一抗为 IgM 型，HRP 标记二抗 HRP-Anti mouse POLYVALENT,1:100,SIGMA,CAT:A-0412稀释度 1：1004、对照系统，必须要做的对照系统如下：阳性对照：标准一抗，阳性血清，阳性上清阴性对照：（1）阴性一抗对照：小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液（2）阴性抗原细胞对照：未感染病毒的细胞，每个待测及对照均须做阴性细胞对照空白对照：不加一抗，用 1%BSA 替代无关对照：与本项目无的第一
