1、2目录（一） 介绍 4（二） 试剂盒物品清单 7（三） 额外附加物品列表 9（四） 酵母菌株 11（五） 酵母载体 14（六） 方法简述：单杂交文库的构建和筛选 16方法简述：双杂交文库的构建和筛选 17（七） 构建用于酵母单杂交的报告质粒载体 18（八） 构建用于酵母双杂交的 DNA-BD 融合载体 19（九） 构建生成 cDNA 文库 21（十） 构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述） 27（十一） 酵母单杂交文库的构建和筛选 28（十二） 酵母双杂交文库的构建和筛选 30方法 A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白 30方法 B:通过共转化的方法筛选目的蛋白 35（
2、十三） 分析阳性相互作用结果 38（十四） 问题解决指南 44（十五） 参考文献 47（十六） 相关产品 50附录 A: 双链 cDNA 合成的典型结果 51附录 B: 酵母感受态的制备LiAc 法 52附录 C： 单杂交对照载体信息 53附录 D： 双杂对照载体信息 54表格列表 Table I BD Matchmaker 酵母菌株的基因型 11Table II BD Matchmaker 酵母菌株的表型 11Table III单杂交系统的载体 14Table IV 双杂交系统的载体 15Table V 各 BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较 19Table VI RNA
3、起始浓度和 PCR 扩增循环数之间的关系 24Table VII单杂交共转化的对照实验的设置 29Table VIII单杂共转化对照实验：期望的结果 29Table IX 双杂交转化的对照实验的设置 33Table X 双杂交配对筛选的对照实验的设置Table XI 双杂交共转化的对照实验的设置Table XII 双杂交共转化的对照实验：期望的结果Table XIII 用于 PCR 筛选菌落的 Assembling Master Mixs3图片列表Figure 1使用 BD Matchmaker 单杂交系统筛选蛋白-DNA 相互作用 4Figure 2使用 BD Matchmaker 单杂交系
4、统筛选蛋白-蛋白相互作用 4Figure 3酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤 5Figure 4构建和筛选 BD Matchmaker 酵母单杂交和双杂交文库 6Figure 5酵母菌株 AH109 和 Y187 中的报告基因 12Figure 6BD Matchmaker 酵母单杂交文库的构建和筛选 16Figure 7BD Matchmaker 酵母双杂交文库的构建和筛选 17Figure 8用 BD SMART 技术合成高质量的 ds cDNA 21Figure 9BD CHROMA SPIN 纯化柱和收集管 26Figure 10通过酵母重整合作用来构建 AD 融合文库 27Figur
5、e 11为双杂交筛选 AD 融合文库 32Figure 12分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略 39Figure 13通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用 42Figure 14用对照用人胎盘 Poly A+ RNA 合成双链 cDNA 51Figure 15p53HIS 对照载体的图谱 53Figure 16pGAD-Rec2-53 AD 对照载体的图谱 53Figure 17pGADT7-RecT AD 对照载体的图谱 54Figure 18pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱 54Figure 19pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱 554（一）
6、 介绍BD MatchmakerTM Library Construction Chien et al., 1991）。当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）这样的报告菌株中相互作用， DNA-BD 和 AD 相接近结合，并激活报告基因转录（Figure 2) DNA-BD 和 AD 的融合序列是将 cDNA 序列克隆进酵母表达载体 pGBKT7 和 pGADT7-Rec 载体中来实现的。pGBKT7 表达了与 GAL4 DNA-BD 融合的蛋白，而 pGADT7-Rec表达与 GAL4 AD 相融合的蛋白。在酵母中，两种融合基因在组成型启动子 PAD
7、H1 下高水平表达的。其他的像 pGBT9、ADH1、pAS2-1 、pBridge 基于 GAL4 的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。pBridge 载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。单杂交和双杂交实验分析的生物学基础单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA绑第结构域在结构上和功能上是分开的。这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA序列并激活下游报告基因的转录（Figure1 和Figure2） ，BD Matchmaker systems使用的GAL4的转录激活域与DNA绑定域是被完全阐述的的转录因子（Z
8、hu, L. pH 4.8)2.5vol. 95% ethanol (20C)10.通过前后的摇晃轻轻的混合。11.把试管放到20C 冰箱或者干冰中一个小时。 （最好：放在20C 过夜，这样可以有更好的效果。 ）12.室温下 14,000 rpm 离心 20min。13.仔细的用移液器移去上清。不要搅动小块沉淀。14.稍稍离心，把剩余的液体摔到底部。15.小心的吸取液体并让小块沉淀空气干燥 10min 中。16.在 20 l 去离子水中重新悬浮小块沉淀，轻轻的混合。这些 cDNA 现在准备与pGADT7-Rec 和 pGADT7-Rec2 在体外重组。继续进行双杂文库的构建，除非你准备使用，c
9、DNA 保存在20C 下。27十、单杂和双杂文库的建立和筛选A、为单杂和双杂筛选建立 GAL4 AD 融合文库1.你不管是单杂筛选还是双杂筛选，建立文库的方法是同样的。在两个方案中，重组介导克隆被用于 BD SMART ds cDNA 与 GAL4 AD 的融合。虽然克隆的方法一样，但是GAL4 AD 克隆载体不一样。使用 pGADT7-Rec2 建立单杂文库。使用 pGADT7-Rec 建立双杂文库。pGADT7-Rec2 和 pGADT7-Rec 在复制的模式上不一样。pGADT7-Rec 是一个高拷贝质粒，它包括 2 的复制起点，在细胞周期中踏可以让载体复制多次。另一方面，pGADT7-
10、Rec2是一个低拷贝质粒，它包括一个自主复制序列，或者 ARS 元件，它可以让载体在细胞周期中复制一次。pGADT7-Rec2 还包括一个着丝点序列，或者 CEN 元件，它确保质粒在减数和有丝分裂中的稳定分离，由于像 pGADT7-Rec2 低拷贝质粒产生更少的假阳性克隆，它们非常适合单杂分析。3. 一个 GAL4 AD 融合文库是通过 BD SMART ds cDNA 和 Sma I-linearized pGADT7-Rec or pGADT7-Rec2 共转化酵母实现的，这也取决于你建立你建立一个单杂或者是双杂的文库。BD SMART ds cDNA 与 AD cloning vecto
11、r 体外重组产生一个完整的 GAL4 AD 表达载体（Figure 10） 。这个建立的结构在 GAL4 AD 融合蛋白中表达 cDNA 片段。由于 BD SMART III and CDS III 序列通过 RT 和 LD-PCR 被加到 cDNA 中，也被增加到 pGADT7-Rec 和pGADT7-Rec2 质粒上，使得一步克隆成为可能。在酵母中，通过 BD SMART cDNA 末端重叠序列的重组，线形的质粒以环化形式存在，成功的质粒整合产生了阳性的(Leu2+)转化子。Figure 10通过酵母重组介导克隆建立 AD 融合文库。通过将 dscDNA（由我们的改进的 BD SMART
12、方法来合成）和 SmaI 线性化的 pGADT7-Rec（双杂交筛选）和 pGADT7-Rec2（单杂交筛选）共转化入酵母来实现 cDNA 到载体的克隆。酵母中的修复酶会将 cDNA 与 pGADT7-Rec（2）同源末端进行修复，重新使质粒载体环化形成完全的表达载体B. 筛选 GAL4 AD 融合文库1、酵母单杂文库筛选（共转化法）通过重组克隆，能同时在单一宿主菌株中完成文库的构建和筛选。如果用户另外准备了DNA 靶/信号质粒（如 pHIS2/ 靶 DNA） ，你可以将其和 cDNA 文库及 pGADT7-Rec2 载体共转化，三个 DNA 元件能形成酵母信号菌株（图 4）。宿主重组过程中形
13、成 pGADT7-Rec2 AD 载体时，文库筛选就开始了。共转化后涂布到培养基上通过 HIS3 营养信号筛选就能很容易的检测到单杂阳性克隆。(详情参阅 sectionXI)2、双杂文库的筛选（酵母融合或共转化法） ，酵母融合或者共转化法皆可筛选双杂文库。如 1 所述，共转化法可以让你在单一宿主菌中建立和筛选文库，这个步骤快速有效。具体的步骤见 Section XI 中 Protocols A 和 B，参照图 7（ Two-Hybrid Library Construction & Screening 流程图） 。28（十一） 、单杂文库的建立与筛选实验开始前请仔细阅读。文库构建前的准备：制备
14、适量的下列 SD 平板： SD/His/Leu/Trp + optimal 3-AT,筛选酵母单杂相互作用（150-mm） SD/Leu，确保文库质粒的转化效率（100-mm） SD/Trp，确保信号质粒的转化效率（100-mm） SD/Leu/Trp，确保筛选得到的克隆数量（100-mm 板）平板冷却（室温 2-3 天或 30C 3 小时） 准备 PEG/LiAc 缓冲液(见 Section III). 要用您的实验样品做有效的平行对照 (Part C, below) 重点：构建文库之前就要准备好所要用的酵母感受态，浏览附录B，并计划好您的实验。A：将ds cDNA, pGADT7-Rec2
15、, 和 pHIS2/靶DNA共转化入酵母菌株Y1871、 准备酵母感受态（附录B）。2、 将下列组分加到15-ml的管子中 20l ds cDNA (from Section IX.I, Step 16) 6l pGADT7-Rec2 (0.5 g/l) 5g pHIS2/target DNA (prepared in Section VII) 20l Herring Testes Carrier DNA, denatured*注：体系最好不要超过60l或步骤3中所加感受态细胞体积的1/10。3、 加入600l的感受态细胞。4、 轻柔混匀。5、 加人2.5 ml的PEG/LiAc缓冲液。6、
16、用移液器轻柔混合3-5 sec.7、 30C 温育45min。15min轻柔混合一次。8、 加入160l的DMSO，混合，将管子在42C 水浴20min，10min轻柔混合一次.9、 700x g 离心 5 min。10、 弃上清，3 ml YPD Plus 液体培养基悬浮沉淀。注：YPD Plus 用于。转化。不要用YPD 培养基。11、30C265rpm 摇床培养 90 min.12、700x g 离心 5 min。13、弃上清，6 ml NaCl 溶液（0.9%）悬浮沉淀。B、筛选酵母单杂相互作用1、将稀释成 1：10，1：100，1：1000 的 100l 转化液分别涂布在 100-m
17、m 的缺亮氨酸，缺色氨酸，或双缺 SD 平板上计数得到的克隆以确定转化效率。2、将剩下的转化液铺到加了 3-AT 的亮氨酸、组氨酸和色氨酸三缺 SD 平板上（150ul cell/150-mm 平板）来做单杂相互作用筛选。3、30C 培养 3-7 天直到长出克隆。4、计数得到的克隆以确定转化效率。a、SD/-Leu 平板上的克隆数*稀释倍数/平板大小（ml）*6ml =每 3ug pGADT7-Rec2载体的转化子，每 3ug pGADT7-Rec2 大约得到 1*106 个转化子。b、SD/-Leu/-Trp 平板上的克隆数*稀释倍数/平板大小（ml）*6ml=得到的克隆，每个文库约有 3*
18、105个克隆。5、将能合成组氨酸的克隆铺在新鲜的加了 3-AT 的亮氨酸、组氨酸和色氨酸三缺 SD平板上。30C 培养 2-4 天，封口膜封好平板，4C 保存。用甘油作储存液-70C 长期保存。5、 参照 sectionXII 来分析阳性克隆。29C、单杂的对照单杂对照表转化酵母菌株 Y187 的： 对照菌株质粒 1、 阳性对照 pGAD-Rec2-53+p53HIS2 （转化） Y187pGAD-Rec2-53+p53HIS22、 阴性对照 pGAD-Rec2-53+ pHIS2 （转化） Y187pGAD-Rec2-53+ pHIS2Table VII酵母单杂共转化对照列表组成 阳性对照（
19、l） 阴性对照（l）pGAD-Rec2-53（500ng/l ） 1.0 1.0p53HIS2（500ng/l） 1.0 pHIS2（500ng/l ） 1.0变性的待测DNA* （10ng/l ） 5 5酵母Y187菌株感受态细胞 50 50PEG/LiAc 溶液 500 500注：将 50lHerring DNA 加到离心管中 100C 加热 5min 变性，冰上冷却。重复几次后加入到 1.5-ml 反应管中。1、 参照附录 B 准备酵母感受态细胞。2、 取两个 1.5-ml 离心管，按 tableVII 所示将 DNA，感受态细胞和 PEG/LiAc 溶液加到离心管中。3、 用枪轻柔的吹
20、打混匀。4、 30C 水浴 30min，每 10min 轻弹管壁一次混匀。5、 每个管子中加 20l 的 DMSO，混匀，42C 水浴 15min，每 7.5min 轻弹管壁一次混匀。6、 高速离心 15sec。7、 弃上清，用 1ml YPD 正型液体培养基悬浮沉淀。 8、 30 C 摇床培养 90 min.。9、 高速离心 15sec。10 弃上清，用移液器取 1ml 的 NaCl 溶液（0.9% ）轻柔悬浮沉淀。11 将稀释成 1：10，1：100 ，1： 1000 的 100l 转化液分别涂布在 100-mm 的缺亮氨酸，缺色氨酸，或双缺 SD 平板上以确定转化效率，并将剩下的转化液铺
21、到加了 3-AT 的亮氨酸、组氨酸和色氨酸三缺 SD 平板上（150ul cell/150-mm 平板）来做单杂相互作用筛选。12 平板 30 C 培养 2-7 天直到克隆长出。13 用 tableVIII 对比您的结果。Table VIII酵母单杂的对照的预期结果对照菌株 SD基本培养基平板 表型（生长）阳性对照：Y187pGAD-Rec2-53+p53HIS2-His/-Leu/-Trp+10 Mm 3-AT +30阴性对照：Y187pGAD-Rec2-53+ pHIS2-His/-Leu/-Trp+10 Mm 3-AT _31（十二）Protocol A：双杂文库的建立与筛选有两种方法去
22、建立 BD Matchmaker 双杂文库：酵母融合、共转化。你选择的方法将决定你使用建立文库的方法。通过酵母融合筛选，用 Protocol A 建立你的文库，通过共转化筛选，使用 Protocol B。关于两个方案的简略对比，请参考 Figure 7。着重注意：在文库构建之间你自己必须准备感受态酵母细胞。请拿出一点时间复习Appendix B 的方案，并如其所述计划你的工作。Protocol A：通过酵母融合筛选在开始之前：灌注 SD agar 平板。你将要需要：在铺板之前，让 SD agar 平板在室温下干燥 23 天，或者在 30C，3 个小时。注：如(Section III)额外材料要
23、求中所说明的，制备这些培养基的缺省补充物不被提供，你必须从商业公司购买或者自己参照 Yeast Protocols Handbook 的 Appendix C 的配比自己准备。 准备对照（Steps 78）对照应该与实验工作平行进行。 准备冷冻培养基：含有 25% (v/v)甘油的 YPD 培养基。 准备 PEG/LiAc 溶液(Section III)。1、 用 ds cDNA 和 pGADT7-Rec 转化 AH109 酵母菌株A、 准备酵母的感受态细胞(Appendix B).B、 在一个无菌预冷的 15-ml 离心管加入下列试剂：转移50 l Herring DNA 到一个离心管中并在
24、 100C 加热 5min。立即把试管放在冰浴中冷却 DNA。加 DNA 到 15-ml 反应试管前再进行一次。C、 加 600 l 感受态细胞到 dna 中D、 轻轻涡旋震荡混合E、 加入 2.5 ml PEG/LiAc 溶液F、 轻轻涡旋震荡混合G、 30C 温育 45min.每隔 15min 混合一次细胞。H、 加入 160 l DMSO,混合，再放置试管到 42C 水浴，20min。隔 10min 混合一次细胞。I、 700 x g 离心 5min。J、 弃掉上清，用 3 ml YPD Plus 液体培养基重新悬浮。注：YPD Plus 是特别配制的去增强转化。这个步骤不使用 YPD 培养基。
