1、1农药残留快速检测新技术的研究进展摘要：农药残留的快速检测方法对食品安全、环境保护具有重要意义。本文综述了农产品中农药残留检测的各种检测新技术，对近年来出现的一些新技术和新动态作了简要介绍，总结了农药残留检测技术的发展方向。关键词：农药残留;检测技术;酶抑制;免疫分析;生物传感器1.引言农药在提高农作物产量和保证人类食物供给方面贡献巨大，但由于农药的过量使用和滥用，食品中的农药残留对人类健康造成的负面影响越来越明显，人类食入被农药污染的蔬菜食品后，残留在其中的农药会在人体内累积或富集，当富集到一定浓度时，将造成人体急性或慢性中毒。因此，发展快速、可靠、灵敏的食品蔬菜农药残留分析方法迫在眉睫。农
2、药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术，它要求精细的微量操作手段，灵敏度高，特异性强。由于各类蔬菜食品样品组成成分复杂，而且不同农药品种的理化性质存在较大差异，因而没有一种多组分残留分析方法能够覆盖所有的农药品种。而且农药残留的检测方法大多以仪器分析为主，采用高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、气质联用、液质联用等。针对传统样品前处理存在的单个样品提取、净化时间较长，有毒溶剂消耗量大等问题，美国农业部农业研究服务中心于 2002 年首次公开发表一种用于农药多残留物检测的快速(Quick)、简便(Easy)、廉价(Cheap)、高效(Effective)、耐用(Rugged)、安全
3、(Safe)(QuEChERS)法 1。随后这种农药多残留物快速检测技术不断得到发展和完善 2-3，并在蔬菜、水果等食品中农药残留快速检测得到广泛应用，所用检测设备，除了 GC-MS，还包括 LC-MS、UPLC-MS/MS 等。鉴于常规检测所需仪器设备昂贵且庞大、笨重，需要熟练专业技术人员操作，只能在实验室内进行抽样检测，难以满足样品现场快速检测的要求，各国科技工作者还应用新原理、新技术试图研究开发出一系列特异性强、灵敏度高、方便快捷、准确安全、简单廉价的快速检测新方法。由于农药品种多、化学结构和性质各异、待测组分复杂，高效、低毒、低残留农药品种不断涌现，在农产品中残留量很低，直接测定非常困
4、难。为此需对样品前处理技术、分析检测技术、快速检测技术进行改进、开发和研究。2.农药残留快速检测技术近年来，一大批农药残留快速分析方法涌现出来，如酶抑制法、免疫分析法、生物2传感器技术、生物活体测定技术、分子印迹技术等。2.1 酶抑制法酶抑制法是利用有机磷及氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死这一毒理学原理，将 AChE 与样品反应，如果样品中没有农药残留或者残留量极少，AChE 的活性就不被抑制，反之，如果农药残留量比较高，AChE 的活性就会被农药所抑制。在酶反应试验中加入底物和显
5、色剂观察颜色的变化或测定某种特定化合物反应的物理化学信号的变化，可判断是否存在有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。目前，依据酶抑制法原理设计的农药残留检测方法主要有速测卡法（纸片法） 、比色法（分光光度法）和胆碱酯酶生物传感器。经过多年的酶抑制法研究开发和实践应用，中国先后颁布了 2 个国家标准和 1 个农业部行业标准，其中GB/T5009.1992003 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测 4提供速测卡法（纸片法）和比色法（分光光度法）2 种快速检测方法，GB/T186302002 蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法-酶抑制法5和NY/T 4482001 蔬菜上有机磷和氨
6、基甲酸酯类农药残留毒快速检测方法 6均为比色法（分光光度法） 。2.2 免疫分析法免疫分析法是利用抗原与抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。抗原是能够引起免疫反应的分子，它是形成特异性免疫反应的必备条件。一个完整的抗原应包括 2 个基本性质：一是免疫原性；二是反应原性（又称抗原性或免疫反应性） 。具备这 2 种性质为完全抗原，仅具有反应原性的物质称为半抗原。农药是典型的半抗原，只有反应原性而无免疫原性，不能诱导抗体产生，只有将它们与大分子蛋白质载体结合，才能刺激机体免疫系统产生抗体。抗原和抗体的制备是免疫分析的关键和基础的步骤。制备抗原时，如果农药分子自身
7、带有供偶联的活性官能团（如氨基、羧基等） ，则可将农药分子直接与蛋白质载体进行偶联反应，否则就必须对农药分子进行衍生化，接上供偶联反应的活性官能团以合成人工抗原。有许多因素直接影响到能否制备出高质量的人工抗原，如选择合适的中间体、活性官能团引入位点的选择、半抗原产物的分离、间隔臂的长短、半抗原与载体分子的偶联比等 7。抗体制备主要有 3 种途径：动物免疫（多克隆抗体） 、杂交瘤（单克隆抗体）技术和重组抗体技术。根据标记物的不同，目前用于农药残留分析的传统免疫分析法主要有 4 种：放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析/酶联免疫吸附分析(EIA/ELISA)、荧光免疫分析(FIA/PFIA)、3化学
8、发光免疫分析(CLIA)。其中，EIA/ELISA 是最为常用的农药残留检测方法。2.2.1 放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）放射免疫分析法是使用以放射性同位素作为标记的抗原或抗体，用 射线探测仪或液体闪烁计数器测定 射线或 射线的放射性强度，来测定抗体或抗原量的技术。徐德武等 8以 3H 标记莠去津建立的放射免疫测定法对土壤中莠去津添加回收率，沙土的添加回收率为 85.795.0，壤土的添加回收率为 86.992.1，表明此法对快速检测土壤中莠去津的残留具有的理论基础。胡秀卿等 9以 14C-克百威建立了克百威的放射免疫测定法，方法最低检测量为 0.175ng/ml
9、，线性范围为 0.2564000.0ng/ml。在线性检测范围内,添加不同浓度克百威的蔬菜样品检测的批内、批间变异系数均小于 10%，在甘蓝菜样品中的添加回收率试验回收率为 93.0 %104.0 % ,变异系数为 4.3 %11.5 %。并且认为此法用于测定蔬菜中克百威的残留是可行且可靠的。放射免疫分析法尽管灵敏度非常敏锐，但是需要昂贵的计数器，存在放射线辐射污染问题，因此在农药残留分析中受到一定限制，并逐步为其他免疫分析方法所取代。2.2.2 酶免疫分析/酶联免疫吸附分析(EIA/ELISA)EIA/ELISA 基本原理与 RIA 相同。将一部分抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免
10、疫活性，使另一部分抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫原性又保留酶的活性。在测定时，把待测的抗原或抗体和酶标抗原或抗体，按照不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体发生反应。用洗涤的方法将固相载体表面上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最终结合在固相载体上的酶量与样品中待测物的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为带有颜色的产物，由于产物的量与样品中待测物的量直接相关，因此，可根据颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到较高的敏感度。具有高度特异性和灵敏度的 EIA/ELISA 特别适合农药残留
11、分析，自 1983 年之后得到了快速发展，由于避免必须使用放射性物质进行工作，而且可达到低检出限（最低检测限达到 10 -10 g/mL 的水平） ，成为农药残留检测最常用方法，并且被美国化学学会(AOAC)与气相色谱、液相色谱一同列为农药残留检测的三大支柱技术。初期的EIA/ELISA农药残留分析研究工作主要针对某一特定农药，即单目标进行分析 10-11。到目前为止，可用 EIA/ELISA 进行单残留检测的农药有100 多种，涉及的农药不仅包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂和杀鼠剂，还包括动植物生长调节剂，农药品种包括有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、三嗪类等传统农药以及苏芸金杆菌、阿维菌素
12、、伊维菌素、多杀菌素等生物农药。虽然国内外大多数 EIA/ELISA 农药单残留分析仍然处于实验室研发阶段，但国外也有针对 40 多种农药开发出的商品化 EIA/ELISA 4试剂盒在出售。例如，Watanabe等 12开发并生产出一种商业免疫测定试剂盒，直接测定果汁中的杀虫剂吡虫啉。2.2.3 荧光免疫分析（FIA 或 PFIA）荧光免疫检测技术的基本原理是用荧光标记抗原，再用标记荧光的抗原与待测农药同相应抗体进行竞争性结合，检测溶液中游离荧光标记物含量。因为无需分离和酶显色步骤，FIA 分析时间较 EIA/ELISA 的短。荧光抗体检测法、吖啶橙免疫荧光法、荧光标记 A 蛋白(FITC-S
13、PA)检测法等传统免疫荧光技术，主要凭借手工操作，效率低，且对结果的判定在一定程度上可受主观因素的影响，近些年来，又建立了荧光激活细胞分类法、时间分辨荧光免疫分析法等新方法。Coons 等 13早在 1941 年就合成了异氰酸荧光黄(FIC)，能有效地标记抗体球蛋白而不损害抗体的活性，但标记困难，不易普及。其后，Riggs 等 14于 1958 年又成功地合成了异硫氰酸荧光黄(FITC)，它既易与免疫球蛋白形成稳定的结合物，又不影响抗体的活性，从而使得免疫荧光分析技术得到了迅速推广，几经改进简化，又出现了吖啶橙免疫荧光法(AOFA)和荧光标记 A 蛋白(FITC-SPA)检测等方法。2.2.4
14、 化学化学发光免疫分析(CLIA)1977 年，以色列 Halmann 等 15通过探索非放射性免疫诊断技术，利用化学发光的基础，先后将固相酶联免疫法与化学发光法结合起来，建立了化学发光免疫分析法(CLIA)。CLIA 具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点。CLIA 应用范围较广，既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可用于核酸探针的检测。CLIA 与放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析(IFA)及酶免疫分析(EIA)相比，具有无辐射、标记物有效期长并可实现全自动化等优点。CLIA 为兽医、医学及食品分析检测和科学研究提供了一种痕量或超痕量的非同位
15、素免疫检测手段。化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为三大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。不同化学发光物质的发光机理和发光性能不同。不同类型的化学发光免疫分析系统原理和方法各异，都要求方法、仪器、试剂三位一体，故在研究和生产上的应用难度较大。尽管如此，CLIA 在近 10 年来仍得到迅速发展，在很多环境监测研究中得到应用。但这种分析方法在农药快速检测中尚未得到广泛应用。2.2 生物传感器生物传感器是将生物分子识别元件（敏感元件）和信号转换元件（换能器）紧密结合，从而检测目标化合物的分析装置。其基本原理为：待测物质和分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产
16、生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的电、光等信号，再经仪表放大和输出，从而达到分析检测的目的。2.2.1 酶生物传感器（enzymesensor）5酶传感器是发展最早，也是目前最成熟的一类生物传感器。它是在固定化酶的催化作用下，生物分子发生化学变化后，通过换能器记录变化从而间接测定出待测物浓度。此类传感器中以乙酰胆碱酯酶(AChE)的催化活性为基础的抑制型酶电极和有机磷水解酶(OPH)为基础的直接酶电极已大量用于有机磷的检测 16-18。为了提高乙酰胆碱酯酶生物传感器的灵敏度，使其更有效地应用于有机磷农药的快速检测，可以选择鸡脑中的乙酰胆碱酯酶作为此类生物传感器的酶源 19。2.2
17、.2 免疫生物传感器（immunosensor）免疫传感器是利用抗原和抗体之间的高度特异性，将抗原或抗体结合在生物敏感膜上，来测定抗体或抗原的浓度。免疫生物传感器包括三个基本部分，固定有抗原或抗体的基体的生物芯片部分，将抗体与被测物特异性结合产生的光、热、压力等物理化学信号转换为电信号的转换器部分，以及将转换器产生的电信号进行放大和数字化的电部分。在农药检测中应用的转换器有光学转换器（如折射仪或反射仪） 、电化学转换器（电阻、电流、电压） 、声波转换器和压力转换器等 20。许园园等 21制备的一种以金为电极根据抗体与抗原之间特异反应前后电极电位的变化定量测定甲基对硫磷的免疫传感器，该传感器的检
18、测下限为 0.085g/ml，检测范围为 0.515g/ml，并可以再生、重复利用。2.3 分子印迹技术分子印迹技术（molecular imprinting）使为获得在空间结构和结合点位上与某一分子（通常称为模板分子）完全匹配的聚合物的实验制备技术。其制备过程是先用功能单体和模板分子以共价键或非共价键形成复合物，再加入交联剂、引发剂和有机溶剂，在一定的条件下聚合，使之生成聚合物，最后通过洗脱的方法，将模板分子从聚合物中除去，这样就在聚合物上留下了和模板分子在空间结构、结合点位完全匹配的三维空穴，这个三维空穴可以重新专一地、高选择地再和模板分子结合，从而使改聚合物对模板分子具有专一的识别功能
19、22。分子印迹聚合物（molecular imprinting polymers，MIPs）是分子印迹技术的核心，国内就分子印迹聚合物的制备进行了相关研究 23，为分子印记技术在这些农药品种的残留检测奠定了理论基础。分子印迹聚合物具有特异的选择性和亲和力，可以为样品中农药残留的分析提供方便，在样品前处理上应用研究最多，形式主要为特异性固相萃取 21, 22和膜分离 24，农药中研究最多的是三嗪类 25。总的来说，分子印迹技术在农药残留检测中的应用还处于起步发展阶段，其核心技术分子印迹聚合物的制备技术尚未成熟和标准化，但是其高度特异的选择性和亲和力具有不可忽视的应用前景。2.4 生物活体测定技术
20、目前利用生物活体开展农药残留检测的主要是发光细菌，已用于检测甲胺磷、敌敌6畏等常用有机磷农药。该方法存在定量不够准确，不能区分农药品种等缺点，但它具有快速、简便、灵敏、价廉的特点，在定性、半定量的现场快速检测中逐渐显示出了其优势。3.展望农药残留的快速检测技术是防止有毒物质污染食品和环境的重要手段，随着公众对食品安全、生态环境的重视，对农药残留的检测技术显得越来越重要，发展各种快速、新型的快速检测技术，将会成为农残检测的研发热点和发展趋势。目前，农药残留分析总的发展方向和趋势有以下几个方面：(1)应用简便、快捷的分析方法进行现场快速初测，成本低，结果准确可靠，对呈阳性反应的样品进行实验室进一步
21、确证。(2)随着人类对蔬菜食品质量要求的提高，加上检测技术的不断进步，使农药残留检出的灵敏度大大提高。新的蔬菜食品残留检测下限必须低于最大允许残留量，在定量方面，采用内标法代替过去的外标法。(3)前处理工作正向着省时、省力、低廉、减少溶剂、减少对环境的污染、系统化、规范化、微型化和自动化方向发展；各种在线联用技术可避免样品转移的损失，减少各种人为的偶然误差，将是农药残留分析方法研究的重点。(4)生物技术与现代理化分析手段相结合不断开发出新的分析技术，对于极性强、难挥发、热不稳定、易分解的农药残留分析有着得天独厚的优势，发展迅速，前景诱人。(5)现在使用和生产的都是化学农药，其主要成份都是分子量
22、较小的有机物，今后生物源农药将代替化学农药，分析重点将转向与生物组织成份很难区分的生物大分子农药，因此未来的分析工作者必须掌握细胞化学、发酵化学、免疫化学等方面的基础知识。参考文献1 Lehotay S J. Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe(QuEChERS) approach for the determination of pesticide residuesM. European Pesticide Residues Workshop, EPRW, Rome, Book of Abstracts, 2002.2 Anastas
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