1、52 2009,Vo130,No12 良晶科学 工艺技术 富含黄酮和生物碱的桑叶提取物的 提取工艺研究 刘杰，潘见，张文成，杨毅，吴方睿 (农产品生物化工教育部工程研究中心，合肥工业大学，安徽合肥 230009) 摘 要：目的：研究桑叶黄酮和生物碱的同步高效提取工艺，通过正交试验获得最佳提取方案。方法：在单因 素试验基础上用正交试验进行工艺参数的优化，获得最佳提取方案。结果：桑叶黄酮和生物碱的最佳同步提取工 艺为液料比10：l(Vm)、乙醇浓度60(pH2)、提取时问2h、提取温度80C、提取2次。结论：用该法对桑叶黄 酮和生物碱进行共同提取，提取率较高，可以获得二者含量较高的提取物。 关键词
2、：桑叶；黄酮；生物碱；1一脱氧野尻霉素(DNJ)；提取工艺 Preparation of Flavonoids and Alkaloidsrich Extract from Mulberry Leaves LIU Jie，PAN Jian，ZHANG Wencheng，YANG Yi，WU Fang-rui (Engineering Research Center of Bioprocess，Ministry of Education，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China) Abstract：Objective：To develop
3、 a technique for synchronized and efficient extraction of flavonoids and alkaloidsthe main component in alkaloids from mulberry leaves was 1-deoxynojirimycin(DNJ)】from mulberry leavesMethods：The optimal pH value of acidic ethanol solution for extraction Was confirmed by single factor test,and then o
4、ther 4 extraction parameters were optimized by orthogonal design based on single factor testResults：The best synchronized extraction effect of flavonoids and alkaloidsWas achievedunderthefollowing conditions：withratioof60acidicethanol solution atpH2todrymulberryleaves powder of 10：1duplicate extract
5、ion at 80for 2 hConclusion：Orthogonal design is feasible to optimize the synchroned extractionofflavonoidsandalkaloidsfrommulberryleaves Key words：mulberry leaves；flavonoids；alkaloids；1-deoxynojirimycin(DNJ)；extraction process 中图分类号：R2842 文献标识码：A 文章编号：10026630(2009)12005205 桑叶，又名“铁扇子”，是桑科植物桑Morus al
6、ba L的叶子，它有着极高的营养价值和药用价值。历代 中医书籍中，均有桑叶可以主治热感冒、肺热燥咳、 头晕头痛、目赤晕花等症的记载【2】。桑叶中含有多种有 效成分，主要有黄酮类、生物碱类及多糖类，其他还 有甾类、挥发油、氨基酸类、维生素和微量元素【 。 桑叶的有效成分中，黄酮类化合物含量较大，具有降 血糖【引、降血脂f51、抗炎【 】及抗癌作用6-7】，而生物碱的 含量虽然低，其中的DNJ(1一脱氧野尻霉素)降血糖的功 效非常显著【s一 。因此，对这二者进行同步提取既可以 优化提取工艺、节省溶剂，又可以制得黄酮和生物碱 两类物质含量较大的提取物，为制药和食品行业的广泛 应用奠定基础。 目前，国
7、内外对于桑叶的提取主要集中于总黄酮的 提取，对于生物碱的提取研究涉及不多，仅局限于微 波提取，而对于总黄酮和生物碱的同步提取未有相关报 道。由于黄酮类化合物是弱极性或非极性物质，而DNJ 是极性碱性物质，单独采用一种或一类溶剂无法对这二 者进行高效提取。本研究拟采用复合的溶剂体系，对 这两种有效成分进行同步高效提取。 1 材料与方法 11 材料与试剂 桑叶，合肥大药房提供，合肥工业大学生物机电 研究所鉴定为植物桑Morus alba L的叶子。 芦丁标准品(纯度95) 中国药品生物制品检定 所；DNJ标准品(纯度99) 美国Sigma公司；AQC 衍生试剂粉 美国Waters公司；乙腈(HPL
8、C专用色谱 收稿日期：2008 0905 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BA106A145) 作者简介：刘杰(1984-)，女，硕士研究生，研究方向为天然药物及其分离工程与技术。Emailvniapplesinacom 工艺技术 良品科学 2DD9_Vo130,No12 53 纯) 美国TEDIA公司；磷酸二氢钾、氢氧化钾、无 水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸、氢氧化钠均为 分析纯。 1_2 仪器与设备 AG135电子天平 瑞典Memer Toledo公司；pHS 2C型精密酸度仪 上海雷磁仪器厂；HH数显恒温水浴 锅金坛市国胜实验仪器厂；SC5202超声仪上海普超 超声波仪
9、器设备有限公司；Sigma 3K15离心机 美国 Sigma公司；Waters 515高效液相色谱系统(配有474荧 光检测器) 美国Waters公司；FS1型涡旋混合器 上 海沪西分析仪器厂。 13 提取实验 131 单因素试验方法 由于黄酮类化合物是弱极性或非极性物质，在乙 醇水溶液中的提取效果较好，而DNJ是极性碱性物质， 易与酸结合成盐，也较易溶于水，因此在酸水中的提 取效果较好。为了兼顾二者的提取，采取酸化乙醇水 溶液提取。 以pH值、提取温度、乙醇浓度、料液比、提取 时间、提取次数，进行单因素试验，基因因素条件为 20g桑叶、pH2、提起温度70、乙醇浓度60、料 液比8、提取时间
10、2h、提取次数2次。试验方案如下： 提取液的pH值：1、2、3；提取温度：50、60、 70、80、90；乙醇浓度：50、60、70、80、 90；液料比：4：1、6：1、8：1、1 0：1、1 2：l；提取 时间：1、2、3、4h；提取次数：1、2、3、4次。 132 正交试验方法 将单因素试验筛选出的对提取影响较大的因素进行 正交试验。 14 桑叶中总黄酮的测定方法 1。41 标准曲线的绘制 世 O7 O6 O5 O4 O3 O2 01 0 0 10 20 30 40 50 60 芦丁含量0gm1) 圈1 芦丁标准曲线 Fig1 Standard curve for rutin for d
11、etermining flavonoids content 以60乙醇为溶剂，精密配制O412mgml芦丁标准 溶液50ml，取00、05、10、15、2O、25、30、 35ml，分别置于25ml比色管中，各加60乙醇至 60ml，加入5亚硝酸钠10ml，摇匀，放置6min，加 入10硝酸铝10ml，摇匀，放置6min，加4NaOH 溶液100ml，加60乙醇溶液至刻度，摇匀，放置 15min，以空白溶液为参比，在波长510nm处测吸光度。 绘制吸光度Y对浓度x(vgm1)的标准曲线，得线性方程 为y=001 13x一00304，R2-_09998。结果表明芦丁在824 5768tgml范围
12、内与吸光度线性关系良好。 142 样品含量的测定 取提取液20ml入25ml比色管中，按141节方法测定。 143 原料中黄酮含量的测定 精密称取1g干燥桑叶粉末(过6O目筛)，加入60 乙醇溶液50ml，80水浴加热回流30min，过滤，滤 渣按上法提取两次，合并滤液后浓缩至50ml，取2ml按 141节方法测定。 M1 黄酮提取率()=100 M1 式中：M 为桑叶提取液中总黄酮量，g；M-为 桑叶原料中总黄酮量，g。 15 桑叶中DNJ的测定方法10】 151 色谱条件 色谱柱：Resteck CI8柱(250mm46mm，5“m)； 流动相：002molL磷酸二氢钾缓冲液(0，5mol
13、L氢氧化钾 调pH值为50)：乙腈=85：15(VV)；流速：1Omlmin；柱 温：25；荧光检测器激发波长250nm，发射波长 395am；进样量10“1。 152 标准曲线的绘制 2 4 6 8 10 时间(min) 图2 标准品色谱图 Fig2 HPLC chromatogram of standard DNJ 15 10 名 5 O 一5 2 4 6 8 10 时间(min】 图3 样品色谱图 Fig3 HPLC chromatogram of DNJ sample ：2 m O 54 2009,Vo130,No12 食品科学 工艺技术 以去离子水为溶剂，分别精密配制浓度为05、10
14、、 30、50、125、250mgL的DNJ标准溶液适量，按 照样品衍生化处理后进样，绘制色谱峰面积y(tvs)对 浓度x(mgL)的标准曲线，得线性回归方程为y=23496x+ 27296，R =09996，线性范围为0525mgL，按三倍 基线噪音计算检出限为02mgL。 153 样品含量的测定 取lOpl提取液于衍生用玻璃小管中，加入80pl K3BO3 缓冲液(pH85)，涡旋混合30s，同时加入lOmmolL 6氨 基喹啉基N羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)衍生化试剂 溶液10 1，室温静置5min，微孔滤膜滤过，取10“1衍 生化后样品按151节色谱条件进样，外标法定量。 15-4
15、 原料含量的测定 准确称取100rag干燥桑叶粉末(过60目筛)于10ml离 心管中，加入lOml 005molL HC1水溶液，超声1min， 离心1 0min(1 0000rrain)，取上清液。残渣按上述方法再 提取一次，合并上清液，按152节方法测定。 DNJ提取率()=100 M2 式中：M 2 为桑叶提取液中DNJ量，g；M 2为桑 叶原料中DN J量，g。 黄酮提取率+DNJ提取率 同步提取率= 2 结果与分析 21 单因素试验 211 pH值的影响 80 一 75 甜 7O 65 l 15 2 25 3 pH 条件：2Og桑叶；70；60乙醇；液料比8：1；2h：2次。 图4
16、pH值对提取率的影响 Fig4 Effects of pH value of acidic ethanol solution on extraction yields of flavonoids and DNJ 对于DNJ的提取来说，当溶液的pH值大于3，溶 液中的H+随着DNJ的萃出而与之结合使溶液变为中性， 因此为了保证利于DNJ萃取的酸性环境，溶液的pH值 应小于等于3。由图4可看出，溶液的pH值对黄酮的 提取影响不大，但对DNJ的提取影响很大，随着pH值 的升高，DNJ的提取率逐渐降低。溶液的pH值为2时， 黄酮和DNJ的同步提取效果较好。 212 提取温度的影响 温度对黄酮和DNJ的
17、提取有一定影响，当温度达到 70时，黄酮的提取率最高，超过70，部分黄酮在 酸性环境下其环状结构可能被破坏，其提取率随温度的 升高略有降低，而DNJ的提取率随温度升高而升高，但 超过80，增幅不明显，由图5可看出，80为同步 提取的较好方案。 得 温度() 条件：20g桑叶；60乙醇；pH2；液料比8：1；2h；2次。 图5 提取温度对提取率的影响 Fig5 Effects of temperature on extraction yields of flavonoids and DNJ 213 乙醇浓度的影响 冰 斛 盛 条件：20g桑叶；70；pH2；液料比8：1：2h；2次。 图6 乙醇
18、浓度对提取率的影响 Fig6 Effects of ethanol concentration in acidic solution Off extraction yields of flavonoids and DNJ 由图6可看出，乙醇浓度升高对黄酮的提取有促进 效果，但浓度超过60，黄酮的提取率下降，而DNJ 的提取率随着乙醇浓度的升高而降低，因此，乙醇浓 度为60时较好。 214 液料比的影响 由图7可看出，液料比越大，黄酮和DNJ的提取 率越高，从生产成本考虑，液料比为10：1时提取黄酮 和DNJ较佳。 工艺技术 目品科学 2000,goL 30,No12 55 8O 篓70 6o
19、50 4 6 8 1O 12 液料比 条件：20g桑叶；70；6O乙醇；pH2；2h：2次。 图7 液料比对提取率的影响 Fig7 Effects of ratio of 60acidic ethanol solution at pH 2 to dry mulberry leaves powder on extraction yields of flavonoids and DNJ 215 提取时间的影响 1 2 3 4 提取时间OI】 条件：20g桑叶；70；60乙醇；pH2；液料比8：1；2次。 图8 提取时间对提取率的影响 Fig，8 Time course of synchronize
20、d extraction of fiavonoids and DNJ 由图8可看出，提取时间超过2h，黄酮和生物碱 的提取率增加幅度都不大，因此，为了节省生产成本， 采用提取时间为2h。 216 提取次数的影响 懈 甾 l 2 3 4 提取次数 条件：20g桑叶；70；6O乙醇；pH2；液料比8：1；2h。 图9 提取次数对提取率的影响 Fig9 Comparison of extraction yields of flavonoids and DNJ among oneoff。duplicate，triple and quadruple extractions 由图9可看出，提取次数对黄酮和
21、DNJ的提取影响 较大，但一般提取2次，二者的提取率可达80以上， 可以得到大量所要提取的化合物，考虑到浓缩时去除醇 水的代价较大，一般采取提取2次为好。 22 正交试验 根据单因素试验结果，选择对提取影响较灵敏的因 素：提取温度、乙醇浓度、液料比和提取时间进行L,(34) 正交试验，方案如表l，结果如表2。 表1 正交试验因素水平表 Table 1 Factors and levels of (3)orthogonal test 表2 b(34)正交试验结果 Table 2 Results of L9(34)orthogonal test and range analysis 由表2试验结果
22、的极差分析得，对桑叶中黄酮和 DNJ的提取来说，因素影响主次顺序为：CBD A，桑叶黄酮和DNJ同步提取的最佳工艺为CsB1D3A3。 而提取时间对提取率的影响比较小，按上述条件做2h与 3h的比较实验，重复实验三次，得出2h比3h的同步 提取率仅少11，为了节省成本，将提取时间定为2h， 所优化的工艺条件为C 3B D zA，即液料比为10：1、乙 醇浓度为60(pH2)、提取时间为2h、提取温度为80、 提取2次。按上述最佳工艺提取，总黄酮的提取率为824， DNJ的提取率为786，同步提取率为8O5。提取液 浓缩干燥粉碎得提取物，其中总黄酮含量为5501mgg， DNJ平均含量为196m
23、gg。 3 结 论 本实验研究了桑叶中总黄酮和DNJ的同步提取工 艺。正交试验结果得出，影响这二者提取效果的各因 素的顺序为液料比乙醇浓度提取时间提取温度： 最佳提取工艺为液料比10：1、乙醇浓度60(pH2)、提 取时间2h、提取温度80、提取2次。在此工艺下， 舳 一】斛 如 56 2009,Vo130,No12 食品科学 工艺技术 总黄酮的提取率为824，DNJ的提取率为786，同 步提取率为805。提取液浓缩干燥粉碎，制成富含黄 酮和生物碱的桑叶提取物，总黄酮、DNJ含量分别为 5501mgg和196mgg。 参考文献： 【1】 江苏新医学院中药大辞典：下册【M上海：上海科学技术出版社
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