1、液相色谱原理2012 Waters Corporation 1色谱法简介square4 色谱法(Chromatography)溯源 100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色素时采用的实验方法 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直2012 Waters Corporation 2立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中随着石油醚提取液向下流过柱子,
2、出现展宽的色带分离出不同的化合物Tswett 的实验2012 Waters Corporation 3Chromato - 颜色Graphy - 图像注: Tswett-俄文的意思是颜色色谱法原理square4色谱法的原理利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱2012 Waters Corporation 4剂,溶剂square4相(Phase):物理
3、化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。色谱法原理分离是一个物理过程。2012 Waters Corporation 5固定相(Stationary Phase)流动相(Mobile Phase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)色谱法的分类square4按流动相的物态分:气相色谱(Gas Chromatography, GC)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(Liquid Chromatography, LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)2012 Waters Corporat
4、ion 6square4按固定相的形态分:平面色谱o 纸色谱o 薄层色谱柱色谱色谱法分类示意图色谱液相色谱 气相色谱2012 Waters Corporation 7柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC色谱法的分类square4按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱(Normal Phase Chromatography)o 固定相的极性大于流动相反相色谱(Reversed Phase Chromatography)o 固定相的极性小于流动相square4有机化合物的极性2012 Waters Corporation 8分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种描述sq
5、uare4注意:此分类法仅适用于液相色谱有机化合物极性示例溶剂极性 非极性水 甲醇 异丙醇 乙腈 THF 乙酸乙酯 CHg21Clg21 CHClg22 己烷2012 Waters Corporation 9CH3COOCH3样品的官能团NHg22X/ArOH/RCOOH CNHg21 ROH RCN 醛/酮 N(R)g21g3 NOg21g3 卤代烷烃 烷烃色谱法的分类square4按分离过程的机理分:吸附色谱(Absorption Chromatography)o 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离分配色谱(Partition Chromatography)o 分离基于样
6、品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)2012 Waters Corporation 10o 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)o GPC(Gel Permeation Chromatography) 固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂o GFC(Gel Filtration Chromatography) 固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液什么是HPLC?square4高g6775液相色谱法HPLC(High Pe
7、rformance Liquid Chromatography )是一种区别于经典液相色谱,基于g1049g2967g6888g8708的g20487g6775能分离g6010g8420g29o 高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器g5038g8714g5059用于各g857g19893g3342g292012 Waters Corporation 11o 医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业g6927g16617在g6063术上,理g16617上,g17671是在g5059用上g1020有g17586大的g2304g4484g12201间HPLC的流程色谱柱(固定相) 数据系统2
8、012 Waters Corporation 12溶剂(流动相)泵进样器检测器废液HPLC的色谱图色谱图(Chromatogram) :色谱柱流g1833物g17737g17654g7663g8826g2967时g5999g982g10830的g2556g5059g1296g2342对时间的g7201g13294g3117,g1701g13284g3199g7478为g1296g2342g5225g5077,g8025g3199g7478为时间2012 Waters Corporation 13色谱峰时间(分)基线 峰高峰宽HPLC分离原理公式与术语square4g17672g7006一g51
9、99由g1049g2967提g1226的g15767g11881分离g10213g1764的色谱图square4g17672g5199色谱图g2394有g863g4347的g1296g5534square4现在g5952g1051g7316g8826g18174色谱图g5029g1044此对一g970g3369g7259理g16617展g5167g16599g166172012 Waters Corporation 14洗脱体积和峰宽square4g17672g970g7006g4395出理g16617和定g888g5999g5364g19503的g3369g7259g8826g1817420
10、12 Waters Corporation 15V0= 无保留化合物的洗脱体积,等于一个柱体积V1= 化合物1的洗脱体积V2= 化合物2的洗脱体积W2= 化合物2的峰宽(以体积计)分离度(R)的定义式square4g12463g2180g16675g7316,分离g5077即g7006g851g4639相对于其g4639宽分g5167g5318有多g176752012 Waters Corporation 16R:分离程度的量度t0t1 t2 t3square4此g3635g7006g1807g857g16592g12486分离g5077的实g12102012 Waters Corporati
11、on 17( )2112WW21t tR+=( ) 8.5.5211-5tR 1-3=+=( ) 2.5.5211-2tR 1-2=+=时间 .5 1 2 5分离度方程式square4分离g5077方程g5182描述g949分离g5077g829g17720g6168性,柱g6775和g4328g18174g3087子之g19235的g1698g12842square4g4274g7006g16627g1062一g5199色谱图g1044g2297g1762定g3761g1156g16146g1762g544g5167g2304和g1095化分离方法的g1228g63012012 Waters
12、 Corporation 18( ) +=1N141R分离因子 柱效 容量因子保留因子(k ):保留能力的量度V0V1 V2 V3square4k是样品与填料作用强度的直接量度2012 Waters Corporation 193.5.5 - 2 k2 =0V0V1V k1 = :公式1.5.5 - 1 k1 =9.5.5 - 5 k3 =时间 .5 1 2 5分离因子( ):峰分离程度的量度V0V1 V2 V3square4是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述2012 Waters Corporation 200V1V0V2V 1k2k = 或 3.5 - 1.5 - 2 = 1
13、2/ 的峰峰9 .5 - 1 .5 - 5 = 13/ 的峰峰时间 .5 1 2 5理论塔板数(N):分离效率的量度square4理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度2012 Waters Corporation 211600 N.5516 NWV16N22=100N2516NWV16N22=PW = .5 PW = 2色谱峰对称性的测量方法USP 拖尾因子（Tailing Factor）:Tf ab)(a2+2012 Waters Corporation 22a b 5 %峰高处的峰宽ab不对称因子(Assymmetry Factor):As中国药典对系统适用性的
14、规定中国药典要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,要达到规定的要求或规定在分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子要求:理论塔板数N大于规定值(按半峰宽法计算)2012 Waters Corporation 23拖尾因子T应在0.95-1.05之间分离度R应大于1.5重复性:连续进样5次,峰面积的相对标准偏差不大于2.0%注:以上数据摘自2005年版中国药典液相色谱的应用（1）square4“分析型液相色谱”square4 目的:得到数据-定性及定量分析灵敏度的要求样品的复杂性2012 Waters Corporation 24样品量的要求精度及准确度
15、的要求容易使用液相色谱的应用（2）square4“制备型液相色谱”square4 目的:得到纯品-分离及纯化化合物的稳定性样品的复杂性2012 Waters Corporation 25制备量的要求纯度的要求，及纯度的鉴定方法的安全性鉴别需定量的色谱峰(定性)square4定性鉴别每个要定量的色谱峰首先用标样确定欲定量之色谱峰的保留时间(Rt)通过比较保留时间,找到未知样中各色谱峰所对应的组份色谱定性是用与标样比较保留时间的方法,判据并不充分square4因此要明确：2012 Waters Corporation 26保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性
16、square4用“标样”的保留时间(Rt)确认被测组份0.300.350.40Ethylparaben2012 Waters Corporation 270.000.050.100.150.200.250.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00AUMinutesUracilPropylparaben进一步的确认(定性)square4标准加入法square4同时用其它方法其它色谱方法(改变机理,如:用不同的色谱柱)其它检测器2012 Waters Corporation 28oPDA, 光谱
17、图比较、谱库检索oMS，质谱图解析、谱库检索其它仪器方法标准加入法举例square4废水样品中五氯g14366g21896PCPg21897的分析梯度曲线 梯度曲线4 ppm3 ppm2012 Waters Corporation 29PCP2 ppm1 ppm确认定量峰的一致性square4确认色谱峰的g815g14115性(纯度)保证每个色谱峰下只有一个被测的组份g7663g7444是g2389有g1696g8816g1833的物g16983g21896杂g16983g21897g5025g6047square4色谱峰g815g14115性(纯度)确认的方法 (PDA)2012 Waters Corporation 30用g1656g10852g955g7344g12496g11544g19300 g7663测g2967比较g1656谱g31172996的纯度g16129理论
