1、青岛农业大学毕业论文题 目：噬菌体 Bp4 和 Bp7 在不同宿主菌中的增 殖效率分析 姓 名： 宫晓宇 学 院： 动物科技专业 专 业： 动物医学专业 班 级： 2011 级 01 班 学 号： 20110608 指导教师： 张灿 2015 年 6 月 03 日目 录摘要 .1Abstract.1引言 .11 材料与方法 .21.1 材料 .21.1.1 菌株与噬菌体 .21.1.2 培养基 .21.1.3 主要仪器设备与器材.31.2 方法.31.2.1 宿主菌的复苏与增殖 .31.2.2 噬菌体的复壮与增殖 .31.2.4 噬菌体与菌液的相互作用 .42 结果与分析 .43 讨论 .6致
2、谢 .9参考文献 .100噬菌体 Bp4和 Bp7在不同宿主菌中的增殖效率分析动物医学专业 宫晓宇指导老师 张灿摘要：为研究噬菌体 Bp4 和 Bp7 在不同宿主菌中的增殖情况，将 Bp4 和 Bp7 分别感染各自不同的宿主菌，通过双层平板法检测其增殖效率，分析其在不同的宿主菌中增殖情况的差异。结果显示:Bp4 在 23 号菌中的增殖效率比在 25 号菌中的增殖效率更高；Bp7 在 39 号菌中的增殖效率比在 25 号菌中的增殖效率更高；Bp4 在 23 号菌中的增殖效率比 Bp7 在 23 号菌中的增殖效率高。关键词：噬菌体 Bp4；噬菌体 Bp7；宿主菌；增殖效率0Proliferatio
3、n Efficiency Analysis of Phage Bp4 and Bp7 on Different Host CellStudent majoring in Veterinary Medicine Gong XiaoyuTutor Zhang CanAbstract：To identify the proliferation efficiency analysis of phage Bp4 and Bp7 on different host cell , Phage Bp4 and Bp7 infected their host bacteria respectively , th
4、e double plate method was used to detect the infection efficiency of phage Bp4 and Bp7 ,and to analyze the discrepancy of proliferation efficiency on the different host bacteria. The results showed that the Bp4 had a higher activity on No.23 than No.25, and the Bp7 had a higher activity on No.39 tha
5、n No.25. Phage Bp4 had a higher proliferation efficiency on No.23 than phage Bp7.Key words：phage Bp4 ; phage Bp7 ; host bacterium ; proliferation efficiency 0大肠埃希氏菌（Escherichia），也称大肠杆菌，是肠杆菌科中一群栖居于恒温动物消化道下段的杆状细菌。1885 年，德国细菌学家帝尔德.埃希查尔氏（Theodor Escherich）首次分离得到的细菌模式株大肠埃氏菌（E.coli） 1，一直被当做正常肠道菌群的组成部分，被认为
6、是非致病菌。直到 20 世纪中叶，大量儿童和幼畜死于大肠杆菌引起的急性腹泻 2，其易于突变性和致病广泛性才逐渐得到人们的重视。鸡群常发的细菌病包括大肠杆菌病、鸡白痢、坏死性肠炎、传染性鼻炎、金 黄色葡萄球菌感染等 3，尤其鸡的大肠杆菌病危害尤为严重，细菌病原在环境中持续存在，随时可感染动物体，并通过感染发病的动物排到环境中。尤其随着集约化养禽业的发展，往往出现细菌病的混合感染和交叉感染，已成为危害养禽业的罪魁祸首。鸡群发病率和死亡率增高，给养禽业的发展造成了严重威胁和重大经济损失。致病性大肠杆菌是医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一，而大肠杆菌病病率在细菌病引发的疾病中居世界首位。1929
7、 年，Fleming 对于青霉素素的发现为细菌病的治疗带来了曙光，青霉素也在二战中拯救了无数人的生命，使得抗生素疗法在接下来的半个世纪中飞速发展 4。抗生素自研发以来，一直被认为是预防和治疗细菌病的有力武器。但由于对抗生素的使用缺乏管制，药物大量滥用，致使致病性大肠杆菌产生耐药性，并且其耐药谱也在不断的扩大，药物的治疗效果显著下降，并出现了多重耐药菌甚至超级细菌 5。由于禽源大肠杆菌血清型众多，仅我国分离到的就有 70 多种，菌株之间缺乏完全保护，研制出具有高保护力的大肠杆菌疫苗十分困难，而新的抗生素的研制又存在周期长、花费高、使用后细菌很快产生耐药性等问题，严重限制了抗生素在细菌病治疗中的应
8、用。抗生素的疗效日益受到质疑，这使得寻求新的治疗方法尤为重要。噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，因部分能引起宿主菌的感染，故称为噬菌体 6。噬菌体作为能特定感染细菌的病毒，在自然界中广泛存在于环境和生物体中。大肠杆菌噬菌体通常从污水、医疗废水、被污染的河水以及人或动物排泄物中就可以分离得到。凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在，是天然的抗菌物质，自然界的微生物圈本身存在单价和多价烈性噬菌体，其中具有宽宿主谱的多价噬菌体1显示出更广泛的杀菌作用 7。对维持自然界微生物的动态平衡起着重要作用。与抗生素相比，噬菌体制剂以不良反
9、应小、不易产生抗药性、无残留且成本低等优点而备受关注。早在 80 年代，英国科学家报到了大肠杆菌噬菌体在兽医临床的成功应用，开创了噬菌体治疗的先河。研究表明，由双链 DNA 噬菌体在溶菌周期末期依靠宿主菌产生的噬菌体感染酶，可作用于细菌细胞壁特有的肽聚糖，同时引起细菌细胞感染。噬菌体可依赖体内的宿主进行复制，因此仅需很小的剂量即可达到治疗目的；目前，对于直接筛选得到的烈性噬菌体的杀菌研究在实验室和现场的观察结果显示了巨大的应用潜力。噬菌体感染酶作为一种新型生物抗菌制剂所表现出的诸多优点也受到了研究者的青睐。分子生物学技术的快速发展，为噬菌体基因组学的研究奠定了基础，截止现在，NCBI 噬菌体基
10、因组数据库中已登录 600 个完成测序的噬菌体基因组，其中有 88 株属于肠道菌的噬菌体。本研究所用 T4 类的噬菌体 Bp7 由本实验室分离，可感染临床大肠杆菌分离株的 45%，并可感染 BL21，DH5，JM109，JM110等大肠杆菌工程菌，属肌尾科噬菌体 8；所用的 N4 类噬菌体 Bp4 分离自鸡场污水，是一株多价噬菌体，其宿主菌包括大肠杆菌血清型为 O15、O 78、O 88等，属短尾噬菌体科 9。本实验针对噬菌体 Bp4 和 Bp7 对其宿主菌的增殖效率，运用双层琼脂平板法进行检测，分析同一噬菌体对不同宿主菌和不同噬菌体对同一宿主菌的作用效果的不同。1.材料与方法1.1材料1.1
11、.1 菌株与噬菌体试验中使用青岛农业大学兽医微生物学实验室分离自发病鸡体内的 3 株血清型为 O78的鸡致病性大肠杆菌分别编号为 23 号、 25 号和 39 号，以及青岛农业大学兽医微生物实验室分离保存的 2 株宽感染谱的大肠杆菌噬菌体，分别命名为 Bp4 和 Bp7。1.1.2 培养基LB 肉汤培养基：称取 25.0g 的 LB 肉汤，加入到 1000ml 蒸馏水，加热煮沸溶解后，分装到试管中，每只试管装 5ml，121高压灭菌 20min；上层营养2琼脂培养基：称取 12.5g 的肉汤和 3.5g 的琼脂粉，加入到 500ml 的蒸馏水，加热煮沸溶解后，分装到试管中，每只试管装 5ml，
12、121高压灭菌 20min；底层营养琼脂培养基：称取 20.0g 的 LB 肉汤和 16g 琼脂粉，加入到 800ml 的蒸馏水，加热煮沸溶解后，分装到三角瓶中，121高压灭菌 20min；生理盐水：称取4.5g 氯化钠和 500ml 蒸馏水。搅拌均匀，分装两瓶，121高压灭菌 20min。1.1.3 主要仪器设备和器械直径为 75mm 的培养皿（用干热灭菌法放烤箱内灭菌），250ml 锥形瓶，0.5ml、1.5ml、10ml 离心管，压滤器，10uL、200uL、1000uL 的移液枪头，121高压灭菌 20min。 医用净化工作台（SW-CJ-2F 型，苏净集团安泰公司）；电热恒温培养箱（
13、HH-B11-360-s 型，上海跃进医疗器械厂）；空气浴振荡器（HZQ-C 型，哈尔滨市东明医疗仪器厂）；冰箱（BCD-248WTPM,海尔集团）；电热手提压力蒸汽消毒器（YXQ-SG41-280 型，上海海康电子仪器厂）；可调式微量移液器（Dragon lab）；电子天平（YB202N 型，上海海康电子仪器厂）；台式冷冻高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）。1.2方法1.2.1 宿主菌的复苏与增殖于普通营养琼脂培养基上用接种环划线接种在-20保存的三株宿主菌菌种，37倒置过夜培养 10h，挑取单菌落接种于 5mL LB 肉汤的试管中，37 160 rpm 振荡培养 10h，得到宿主菌悬
14、液，4保存备用。1.2.2 噬菌体的复壮与增殖一般情况下，4条件下保存的噬菌体母液效价较低，达不到实验所需条件。所以在实验之前，用双平板法，进行噬菌体的复壮及增殖。方法如下：先将噬菌体原液用无菌生理盐水进行 10 倍比稀释，至 10-5、10 -6两个浓度梯度。取 20uL 新鲜培养的 25 号宿主菌悬液与 10uL 噬菌体 Bp4 稀释液在离心管中混匀，再取 20uL 新鲜培养的 39 号宿主菌悬液与 10uL 噬菌体 Bp7 稀释液在离心管中混匀，37静置 5min 使噬菌体能充分吸附宿主菌，然后将混合液加入冷却至 65的上层琼脂中，搓动试管混匀后迅速倒入已准备好的的底层琼脂平板上，轻轻旋
15、转平板使之分布均匀，待琼脂凝固后 37倒置培养 6h，形成噬菌斑。3制备噬菌体浸出液：用无菌镊子挑取单个新鲜噬菌斑，置于盛有 500L 生理盐水的无菌 Ep 管中，40水浴作用 30min，4000r/min 离心 10min 得到浸出液。噬菌体液体增殖：分别取 200L 噬菌体浸出液和 200L 宿主菌新鲜增殖液，加入至盛有 5mL 营养肉汤的试管中，37，170r/min 振荡培养，可见到混合液先逐渐变浑浊，再逐渐变澄清，即得到噬菌体增殖液,4保存备用。1.2.4 噬菌体与菌液的相互作用将保存好已测定完浓度的噬菌体增殖液 4000r/min 离心 5min，取上清备用。将噬菌体增殖液用灭菌
16、生理盐水进行 10 倍比稀释到 10-5、10 -6，与对应宿主菌相互作用，具体分组见表 1.每个稀释度做两个平行样，以保证数据准确性。具体步骤如下：取噬菌体稀释液 10uL 与 20uL 宿主菌增殖液混匀在 37恒温条件下相互作用，使噬菌体充分吸附宿主菌。5min 后将此混合液加入到溶化后冷却至 48的上层营养琼脂中，立即用手掌快速搓动试管混匀，倒入已做好标记的底层琼脂上，轻轻旋转平板使上层培养基铺满平板，待琼脂凝固后，37倒置培养 68h，计数噬菌斑。表 1. 噬菌体 Bp4、Bp7 在宿主菌中的增殖分组 组份 Bp4+23 Bp4+25 Bp7+23 Bp7+392.结果与分析将分别在
17、25 号宿主菌和 23 号宿主菌增殖的噬菌体 Bp4 和在分别在 39 号宿主菌和 23 号宿主菌增殖的噬菌体 Bp7，与 23 号宿主菌、25 号宿主菌、39 号宿主菌通过双平板法计数，并作平行对照，检测其增殖效率。统计后结果见表 2和表 3。表 2.噬菌体 Bp4和 Bp7对不同宿主菌的增殖效率（噬菌体稀释度 1*10-5）噬斑数（个） 23 号菌 25 号菌 39 号菌Bp4+23 28 23 29 53 - -Bp4+25 58 51 182 200 - -Bp7+39 79 82 - - 208 224Bp7+23 17 20 - - 35 394表 3.噬菌体 Bp4和 Bp7对不
18、同宿主菌的增殖效率（噬菌体稀释度 1*10-6）噬斑数（个） 23 号菌 25 号菌 39 号菌Bp4+23 4 5 17 12 - -Bp4+25 8 9 20 24 - -Bp7+39 17 14 - - 34 27Bp7+23 2 3 - - 8 9通过对比不同稀释度的噬菌体在宿主菌中增殖的噬菌斑数量发现，当稀释度为 10-6时数据较有代表性，根据该稀释度下噬菌斑计数结果作图，比较噬菌体 Bp4 和 Bp7 在其不同宿主菌中的增殖效率，和 Bp4 和 Bp7 在其共同宿主菌中的增殖效率。结果见图 1-3。图 1 噬菌体 Bp4对不同宿主菌的增值效率5图 2.噬菌体 Bp7对不同宿主菌的增
19、殖效率图 3.不同噬菌体在 23号菌中增殖效率的比较由图 1 可知，Bp4 的宿主菌是 25 号和 23 号菌，Bp4 无论在 23 号菌或 25 号菌中增殖结果都是一致的，结果显示 Bp4 在 25 号菌中的增殖效率比在 23 号菌中的增殖效率高。由图 2 可看出，Bp7 的宿主菌是 39 号菌和 23 号菌，Bp7 无论在 23 号菌或 39 号菌中增殖结果都是一致的，结果倾向于 Bp7 在 39 号菌中的增殖效率比在 23 号菌中的增殖效率高。由图 3 可知，Bp4 和 Bp7 在 23 号菌中都可增殖，为 Bp4 和 Bp7 的共同宿主菌，用双平板法检测其增殖效率，用 23 号菌增殖的 Bp4 和 Bp7 与 23 号菌相互作用后，结果都显示 Bp4 在 23 号菌中的增殖效率比 Bp7 在 23 号菌的增殖效率高。3.讨论大多数噬菌体依靠感染酶水解宿主菌细胞壁中的肽聚糖从而释放子噬菌体。大分子噬菌体（如双链 DNA 噬菌体）一般都是通过 Holin10穿孔素蛋白和感染
