1、第五章 检疫性真菌病害,小麦矮腥黑穗病 Wheat dwarf bunt 小麦印度腥黑穗病 Wheat karnal bunt烟草霜霉病 Tobacco blue mold 马铃薯癌肿病 Potato wart 榆树枯萎病 Dutch elm disease,复习思考题,植物检疫性真菌常见检疫检验技术,直接检验 染色检验 洗涤检验 保湿萌芽检验 分离培养检验,1.直接检验,适用范围：具明显症状的植物材料 主要工具：放大镜或解剖镜，主要是利用肉眼现场快速初检,2.染色检验法,原理：染病的组织，或病原菌本身，经特殊的化学药品处理后，可带有特殊的颜色 例如：马铃薯癌肿病（Synchytrium en
2、dobioticum）薯块上癌瘤不明显时，可做徒手切片，加1滴1的“藏花红”染色液，健康组织细胞壁呈亮红色，感病组织细胞壁呈暗红色。,3.洗涤检验法,原理：种子表面常附着真菌孢子，将一定量的样品放入容器内，加一定量的无菌水，充分振荡，可使病菌孢子洗涤下来，而后离心后，可沉淀，镜检沉淀物可确定其种类和数量。 主要仪器和试剂：振荡器、离心机、显微镜、0.1吐温溶液等 主要试验流程如下：,称取样品,洗脱孢子（振荡）,离心富集,镜检计数,影响检验结果的因素： 种子表面的病菌孢子不一定能完全洗涤下来； 离心管内，悬浮液表面常形成一层极难沉降的孢子薄膜，管壁上也可能黏附孢子； 将悬浮液滴于玻片时，由于孢子
3、迅速沉淀，造成一些视野间孢子分布极不均匀； 操作不够严格，造成人为误差。,4.保湿萌芽检验,原理：种子携带的真菌，无论外表黏附的还是潜伏种子内的，在种子萌发阶段即可开始侵染，甚至有些在种子还未萌发时就可长出病菌。 主要仪器及试剂：吸水纸、沙土、冰箱、培养箱等。 主要包括：保湿培养检验、沙土萌芽和土内萌芽检验等三种方法，其中保湿培养检验法是国内外最常用的一种方法。,吸水纸法,无菌吸水纸（3层）,灭菌培养皿,吸水,11.5cm,培养、观察,12h光照黑暗交替,恒温,所观察到的结果示意图如下,5.分离培养检测,常规植物病理学方法,小麦矮腥黑穗病 Wheat dwarf bunt,分布：是麦类黑穗病中
4、危害最大、防治最难的一种病害，它于1847年及1860年先后发现于捷克和美国，在全世界范围内传播和蔓延，目前已在欧洲、北美、南美、澳洲、亚洲、非洲等40多个国家发生。 寄主：禾本科5个族，18个属，65个种。主要栽培植物有冬小麦、大麦、黑麦，冰草属为天然发病的主要禾草寄主。,危害性：1962年美国减产68.7，1972年西部7州，平均减产17，损失1. 2亿Kg。菌瘿可存活10年以上。 症状：系统侵染性，表现为：病株特矮（1/31/2），分孽特多（1倍），病穗特密，病粒特硬，有鱼腥臭味。,病原菌：Tilletia controversa J.G. Khn, in Rabenhorst, Hed
5、wigia 13: 188 (1874) Position in classification: Tilletiaceae, Tilletiales, Exobasidiomycetidae, Ustilaginomycetes, Basidiomycota, Fungi 形态特征：冬孢子 ，冬孢子萌发。 生物学特征：冬孢子萌发-215（38） ，弱光400600lx，土壤含水量3588，萌发周期长3个月。冬孢子内含有内源孢子萌发抑制剂。 生理分化：美国15小种，德国8个小种。 初侵染来源：土壤带菌，冬孢子可存活1年，菌瘿可存活310年。 传播：种子；运输工具、包装材料及下脚料；粪肥；雨水。,
6、发病规律：侵染期长，12月4月，12月是盛期，幼嫩分蘖处侵入，细胞间蔓延，50天到生长点，随寄主生长，菌丝进入穗原始体，到各个花器，破坏子房，形成冬孢子堆。长时间38 低温利于侵染；冬麦区苗期日平均温度010 达45d以上，即使没有雪覆盖也同样利于发病。 TCK的循环: 流行因素：大面积感病品种、足够菌源、冬季日均温010 的日数40d、稳定积雪70d以上，积雪厚度10cm以上。 国内适生区域：西北高原冬麦区和新疆、青藏高原晚播冬麦区极为适宜病害的发生，属高度危险区；江淮流域及华北、东北冬麦区基本适合病害发生，属危险区；西南高海拔地区有时也具备病菌入侵条件，也可能受害；春麦区不发病。,检验与检
7、测： 直接检查：放大镜 菌瘿 洗涤检查：50g100ml无菌水，振荡5min，1015ml离心3min，定容，制片观察。 冬孢子鉴定：孢子形态鉴定（网脊高度、胶鞘厚度、网目径、孢子大小、不育细胞等）。 冬孢子自发荧光实验：TCK孢子于荧光显微镜下有自发荧光现象，而TCT孢子则无。 冬孢子萌发试验：5 、17 下，光照。矮腥孢子5 下21d开始萌发， 17 不萌发。 PCR技术：引物5-TGACAACGGATCTCTTGGTT-3、 5- TCACCAACTCCAAGCAATCT-3 ,206bp处有特异扩增带。,检疫和防治 进口小麦和原粮必须进行检疫，病麦需除害处理 带菌小麦原粮必须集中在几个
8、规定有条件的口岸加工灭菌处理。采用高温灭菌法，13030min或120 1h。 病区用40五氯硝基苯，种子重量0.5的药量拌种，并在播种沟内施药处理。或单用1的药量拌种 重病地应轮作倒茬或改种春小麦。冬小麦晚播可减轻发病。 种植抗病品种。,小麦印度腥黑穗病 Wheat karnal bunt,分布：印度、巴基斯坦、尼泊尔、阿富汗、伊拉克、土耳其、黎巴嫩、叙利亚、原苏联、瑞典、美国、墨西哥、澳大利亚等。 寄主：小麦、硬粒小麦、六倍体小麦,危害及重要性：产量影响不大，对品质影响较大，3%面粉具臭味（三甲胺）。 症状：局部侵染性，部分黑穗病，麦粒的一部分被侵染，小穗顶端麦粒黑斑，颖片张开，主要侵染胚
9、乳，一般不侵染胚，在种子腹面表皮下形成冬孢子堆，背面胚乳部分仍完好。,病原菌： Tilletia indica Mitra 异名：Neovossia indica Position in classification: Tilletiaceae, Tilletiales, Exobasidiomycetidae, Ustilaginomycetes, Basidiomycota, Fungi 冬孢子：棕褐色，球形，近球形，2249m ，外壁棘状突起，1.55m ；未成熟黄色，透明胶质鞘，成熟消失，外壁有尖形尾丝。不孕细胞球形，近球形，泪珠状，半透明，淡黄褐色，附着菌丝体残体，1333m 。 冬
10、孢子萌发：4月以上休眠期，萌发产生10190m 先菌丝，上产生65185个担孢子，长镰刀形，可不配对结合，而直接产生芽管，作侵染菌丝用。,A partially mature teliospore showing ornamentation in median view,A partially mature teliospore showing ornamentation in surface view,初侵染来源：种子带菌，土壤带菌，秸秆和粪肥等带菌。冬孢子可存活5年。 传播：种子；运输工具、包装材料及下脚料；粪肥；雨水;也可气传。 生理分化：异宗配合，印度7个生理小种。,发生规律：冬孢子萌
11、发的适温1522 ，扬花期先菌丝产生的担孢子随气流传播到麦穗上，产生次生担孢子，上生芽管，从颖片、外稃和内稃开张的气孔侵入。在一定温度范围内，该病流行与湿度正相关，与温度反相关。因此，扬花期遇多云、寡日照、细雨多雾的高湿天气适宜发病。,检验方法： 直接检查：根据病粒的特有症状鉴定 洗涤检验 发病轻的麦粒可用0.2NaOH浸24h（1825 ），吸去多余液体，实体显微镜下观察。乌黑发亮的种子有病，淡褐色无病。 PCR技术：扩增引物为5-CGTGTGAGCCATGCTACGACT-3和5-AACTTCCAAGGCGACCGTTT-3，在743bp处有一特异性扩增带，其他近似种或相关种均未出现该扩增
12、带。,检疫和防治： 严格检疫 高温灭菌：带菌小麦原粮必须集中在几个规定有条件的口岸加工灭菌处理。采用高温灭菌法，85，相对湿度80，处理3min可以杀死孢子，处理5min可以杀死菌瘿。 农业措施：小麦与鹰嘴豆间作，适时早播，病轻。 化学防治：三唑类和苯并吡咯类拌种，喷洒药剂（萎锈灵）等。,烟草霜霉病 Tobacoo blue mold,分布与危害：1891年澳大利亚首先报道，后传入欧洲、非洲、美洲和亚洲，现广泛分布，中国尚未发现。苗床和田间均发病，蔓延速度极快，引起大量植株枯死，是烟草的毁灭性病害。1960年欧洲流行，法国和比利时烟草损失8090，1961年损失干烟叶100,000吨。 寄主范
13、围：专性侵染，寄主范围窄，主要侵染烟草，自然条件下，还可侵染番茄、辣椒、茄子和马铃薯等茄科植物，人工接种可侵染矮牵牛、酸浆和灯笼草等。,症状： 发病时期：主要在苗期，大田期也发生。 发病部位：主要为害叶片。 症状特点：因病原菌的生理型不同，受害部门也有差异，如美国流行的是美国生理型。主要危害幼苗，成株感染较少，不易感染茎部；欧洲流行提澳洲生理型，其危害特点是除危害烟草幼苗外，还能危害烟茎和成株。病叶表面和边缘表现淡黄色、黄绿色、暗绿色的病斑，病斑为圆形、近圆形、多角形或形状不规则。病害发展迅速时，病斑可相互连接起来，布满整个叶片，或没有明显的界限。病叶背面密生灰蓝色或灰褐色的霜霉层，干烟叶一般
14、表现为灰白色或灰褐色，苗床上的病苗表现为灰蓝色。条件适宜时，叶表面也产生霜霉层，随着病斑的发展，逐渐变褐色，甚至深褐色，最后成为枯褐色。干烟叶上病斑表面有突起，老病斑边缘有一圈青褐色环，与马铃薯晚疫病症状相似。烤后的烟叶症状尚隐约可见；空气湿度大时，病斑更为明显。,烟草霜霉病与其他病害的症状区别：烟草霜霉病的病斑有时容易与烟草黑胫病叶部症状相混淆。因黑胫病叶部病斑圆形，表现青褐色大斑，呈水渍状，背面霉层稀少，毛短色白，与霜霉病仍有区别。另外，烟草霜霉病染病部位产生霜状霉层，不仔细观察与烟草白粉病产生的白色粉状霉层也易于混淆，但因霜霉病的霜状霉层大多局限于病叶背面，而白粉病的粉状霉层则在叶片的正
15、反两面都产生，只要仔细观察亦不难区别。,病原菌：Peronospora hyoscyami de Bary f.sp. tabacina (Adam) Skalicky异名 Peronospora tabacina D.B. Adam Peronospora hyoscyami de Bary Peronospora nicotianae Speg 英文名称：blue mould of tobacco ；tobacco blue mould ；downy mildew ；angular tobacco leaf spot ；tobacco black fire ；tobacco wildfir
16、e 分类地位： Chromista藻物界（也称假菌界)、Oomycota, Oomycetes, Peronosporales, Peronosporaceae,病原菌形态特征 细胞内菌丝产生细胞内吸器，孢囊梗在叶片的下表面通过气孔口伸出，长450-750m，二叉式分枝，基部分枝成锐角，上部呈直角，顶端弯曲，末端尖，上生孢子囊；孢子囊透明无色，柠檬形，大小16-28 13-17m，每个孢子含 8-22 核；卵孢子黄褐色到红褐色，球形，大小 24-75 m, 周围光滑或粗糙的外膜，干燥时收缩成棱角状皱纹，在死亡叶片、叶柄和茎的叶肉中大量存在。,病原菌生物学特征： 在适宜湿度条件下，孢子囊生成的最
17、低温度为1-2，最适宜温度为15-23 ，最高温度为30 ，而在最适温度条件下，孢子形成所需的最适湿度范围是叶面相对湿度97-100%。 孢子囊萌发的温度范围为：最低 l一2，最适为1522，30有少量萌发，35萌发率为0.1%。 卵孢子有极强的抗逆性，经贮存4年后仍能存活；在80下烘烤4天，然后在35、RH5060条件下发酵，孢子仍有侵染能力。 致病性分化：本病菌的美国生理型和澳洲生理型致病性不同。澳洲生理型存在有3个生理小种。,传播途径： 气流传播：气流传播是烟霜霉病得以造成重大危害的主要途径，而孢囊孢子是进行气流传播的主要病原体，根据气流及温度、湿度条件，孢子在两小时之内，可传播200k
18、m最高可达1600km，由于孢子所具有的高度传播能力，在南欧和北非早春的气体孢子可直接成为初侵染的来源。卵孢子传播：在美国东南部烟区，存在于病土中的卵孢子和存在于病残烟组织中的越冬菌丝的旧苗床是翌年春季侵染来源，在加拿大甚至中欧和北欧，卵孢子也是翌年侵染的主要来源，Krober曾报告50个月的卵孢子仍可造成较低的侵染率，但田间发病则很稀少。在南欧，卵孢子在初侵染上的传播一直未能肯定。虽然如此，由于卵孢子所具有的特殊抗逆性，存在于烟株下部叶片的卵孢子，可能是病害远地传播的另一途径。,发病规律： 越冬：菌丝体在田间或温室的病株、自生烟苗、野生烟草上越冬；卵孢子能在病株残体和土壤中越冬。 发病条件：
19、温度和湿度时影响病害发生和流行的主要因素，夜间温度10，白天21，有间歇小雨或结露时间长或叶面湿润，光照弱等有利于病害发生。 适生区域：中国大部分烟草种植区。,检验方法 1.症状检查： 根据现行抽样规定，对每批烟叶按上、中、下三层以对角线抽取烟叶,来自烟霜霉病疫区的烟叶，每品种每批抽样总数应不少于5万张，每品种、各等级烟叶抽样总数应为1万至2万张。抽取的烟叶样品，应在杜绝污染的条件下适当回潮，使叶面舒张，然后在4x40W-5x40W白色荧光 灯照射下检查病斑，病斑淡褐黄色，常受叶脉所限，呈不规则圆形，易于透光，叶背面可见霜霉霉层，可以直接用立体显微镜（50x）观察孢梗及孢囊群体，也可在光学显微
20、镜下鉴定病原。,2. 洗涤检验孢子囊： 3.组织透明法检验卵孢子：卵孢子大多聚生于叶脉附近，可剪取小块病斑组织（约0.5cm）滴加少许PH7磷酸缓冲液（0.02M）在-20C冻融过夜，然后用0.02MPBS（PH=7）匀浆，匀浆液经80um及90um双层筛过滤并清洗取集20um筛上物离心，检查沉淀液。也可在密闭条件下有高速粉碎机（10000rpm） 粉碎，再将粉碎后的叶组织用网目约80um的细目筛过后取筛下物，经乳酚油透明后检查。,4.试植检查：为观察子叶或幼苗戡期的症状，可将种子用0.2%NaClO灭菌后，植入盛有2%琼脂培养基或任何用于植物水培的盐类培养基的密封玻皿内，每200ml 培养基
21、平面可播养1000粒种子，在20C光照条件下培养，种子出苗后的2周内，观察烟种幼苗有无染病迹象，对可疑幼苗所生成的霉层进行镜检鉴定。,5. 烟丝检查 仔细挑选带有暗绿色或灰褐色病斑的烟丝碎片，在双筒解剖镜下检查，选取有霜霉层病斑的碎片,置于载玻片上，滴上2-3滴苯胺兰乳酚油，用解剖 针挑开铺平，加盖玻片，在酒精灯上离火焰几公分高缓缓加热煮沸，注意不要过火，以免液体喷出玻片外，并从盖玻片外补充苯胺兰乳酚油，保持不干。煮沸5-10分钟，待玻片冷却后，用吸水纸吸去多余液体即可镜检。叶片组织染成淡蓝色，卵孢子呈淡黄色至黄褐色，孢子囊和梗染成蓝色。如叶片透明度不够，还可重复加热煮沸，直至完全透明。如果需要检查的病叶较多，也可以在凹玻片上煮沸，待透明后再转到玻片上镜检。,检疫和防治 1.1966年我国政府公布烟霜霉病为对外检疫对象，1990年又颁布法令，禁止从疫区进口烟叶及种子和有关易感植物，对因科研需要自疫区引进烟属植物幼苗的，应在指定的隔离检疫圃隔离试种，以严防此病传入。 2.灭除病原。任何新区一旦发生烟霜霉病，应立即采取封锁病区，根除发病点的措施，除处理苗床或病田外，也要消灭病菌的各种越冬场所，包括消灭感病烟株病残体，观赏烟属和野生烟属植物，禁止病区温室栽培试验用的烟属植物。,
